用于核酸酶介导的基因组工程改造的递送方法和组合物与流程

本公开内容涉及基因组工程领域，特别是细胞的基因组的靶向修饰。

背景技术：

0、发明背景

1、已描述用于基因组dna的靶向切割的各种方法和组合物。可使用这些靶向切割事件，例如，引起靶向突变，引起细胞dna序列的靶向缺失，及促使在预定染色体基因座靶向重组。参见，例如，美国专利no.8,586,526；8,329,986；8,399,218；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960及美国申请no.14/278,903，所述专利申请的公开内容针对所有目的以其全文引用的方式并入本文。

2、这些方法通常涉及使用工程改造的切割系统以引起双链断裂(dsb)或靶dna序列缺口，因此，通过产生错误的过程诸如非同源末端连接(nhej)修复断裂或使用修复模板(同源导向的修复或hdr)修复可导致基因敲除或受关注的序列插入(靶向整合)。可通过使用特定核酸酶诸如工程改造的锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)，使用以工程改造的crrna/tracr rna(‘单导向rna’)导引特定切割的crispr/cas系统和/或使用基于argonaute系统的核酸酶(例如，从高度好热菌得到，称为‘ttago’,(swarts等人(2014)nature 507(7491):258-261)，进行切割。

3、使用一种上述核酸酶系统的靶向切割可采用hdr或nhej介导的过程中任何一种过程用于将核酸插入到特定靶位置。然而，将核酸酶系统和供体同时递送到细胞可能是问题所在。例如，通过转导质体进入到细胞中来递送供体或核酸酶可能对受体细胞，尤其对为初级细胞且不如来自细胞系的细胞强健的细胞有毒。

4、cd34+干细胞或祖细胞是特征为其自我更新和/或分化为淋巴细胞(例如t细胞、b细胞、nk细胞)和髓系(例如单核细胞、红血球、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞)能力的异质性细胞组。其异质性源自cd34+干细胞群体中存在多个常反映特定群的多能性(不论定向的谱系)的子群的事实。例如，为cd38-的cd34+细胞是较为原始的未成熟的cd34+祖细胞(也称为长期造血祖细胞)，而那些为cd34+cd38+的细胞(短期造血祖细胞)是定向的谱系(参见stella等人(1995)hematologica 80:367-387)。当这一群体接着进一步以分化途径发展时，cd34标记物失去。cd34+干细胞在临床细胞疗法中具有巨大的潜力。然而，部分地归因於其异质性，可能难以在细胞上进行基因操作，诸如基因敲除、转基因插入等。具体来说，这些细胞通过常规的递送载体转导是不充分的，最原始的干细胞对修饰敏感，在引起的dna dsb后，hdr受到限制，及在延长时间的标准培养条件中hsc维持不足。另外，其它受关注的细胞(仅举非限制性实例来说，心肌细胞、中型棘突神经元、初级肝细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞和肌细胞)转导以进行基因组编辑可能不如其它细胞成功。

5、因此，仍需要用于对cd34+细胞和其它受关注的毒性较小但更有效的细胞基因组工程改造的组合物和方法。

技术实现思路

0、发明概要

1、本发明描述适用于基因疗法和基因组工程改造中的组合物和方法。具体来说，所述的方法和组合物涉及将核酸引入到细胞诸如初级细胞包括造血干细胞/祖细胞(hsc/pc)和t细胞中。此外，本发明的方法和组合物适用于递送包含受关注的供体dna的aav颗粒到这些细胞。

2、在一些方面，本发明包括出于基因组工程改造的目的而递送至少一种核酸酶到细胞(例如，hsc/pc)。在一些实施方案中，核酸酶呈肽递送，而在其它实施方案中，核酸酶呈编码核酸酶的核酸递送。在一些实施方案中，使用不只一种核酸酶。在一些优选的实施方案中，编码核酸酶的核酸为mrna，及在一些情况中，mrna经过保护。核酸酶可包括锌指核酸酶(zfn)、tale核酸酶(talen)或crispr/cas或ttago核酸酶系统或其组合。在一个优选的实施方案中，通过电穿孔递送编码核酸酶的核酸。

3、一方面，本文提供一种将一个或多个转基因整合到分离的细胞的基因组中的方法，所述方法包括按顺序将转基因和至少一种核酸酶引入到细胞中以使核酸酶介导转基因的靶向整合。因此，在某些方面，提供一种将一个或多个转基因整合到分离的细胞的基因组中的方法，所述方法包括：将(a)包含一个或多个转基因的供体载体和(b)至少一种核酸酶引入到细胞中，其中所述至少一种核酸酶切割细胞的基因组以使所述一个或多个转基因整合到细胞的基因组中，及进一步地，其中(i)如果供体载体先于所述至少一种核酸酶之前被引入到细胞中，则在引入供体载体后的48小时内引入所述至少一种核酸酶到细胞中；及(ii)如果所述至少一种核酸酶先于供体载体被引入，则在引入所述至少一种核酸酶后的4小时内引入所述供体载体到细胞中。在某些实施方案中，所述方法可以包括(a)将包含一个或多个转基因的供体载体引入到细胞中；(b)培养所述细胞48小时以下(例如，几秒到48小时或其间的任何时间)；及(c)将至少一种核酸酶引入到所述细胞中，其中所述至少一种核酸酶切割所述细胞的基因组以使所述一个或多个转基因被整合到所述细胞的所述基因组中。或者，所述方法可以包括：(a)将至少一种核酸酶引入到细胞中；(b)培养所述细胞24小时以下(例如，几秒到24小时或其间的任何时间)；及(c)将包含一个或多个转基因的供体载体引入到所述细胞中，其中所述至少一种核酸酶切割所述细胞的基因组以使所述一个或多个转基因被整合到所述细胞的所述基因组中。可以重复所述方法步骤以将额外的转基因整合到相同和/或不同的基因座中。在某些实施方案中，将所述细胞培养(步骤(b))24小时以下(例如，几秒到24小时或其间的任何时间)。在其它的实施方案中，例如，当核酸酶在引入供体载体之前被引入时，将所述细胞培养4小时以下。

4、可以使用任何细胞，例如，造血干细胞(例如，cd34+细胞)或t细胞(例如，cd4+或cd8+细胞)。供体载体可以呈病毒或非病毒载体例如aav载体(例如，aav6或aav6嵌合载体(诸如aav2/6)等)引入。核酸酶(例如，zfn、talen、ttago和/或crispr/cas)还可以使用病毒或非病毒载体例如呈mrna形式引入。在某些实施方案中，核酸酶靶向安全港基因(例如，ccr5基因、aavs1基因、rosa基因、白蛋白基因等)。转基因可以编码罹患疾病(例如，溶酶体储积病、血红蛋白病、血友病等)的受试者中所缺少或缺乏的蛋白质，例如，治疗性蛋白质。在某些实施方案中，描述一种对有此需要的受试者提供一种或多种蛋白质的方法，所述方法包括：根据任何本文所述的方法将一个或多个编码一种或多种蛋白质的转基因引入到分离的细胞中及将所述细胞引入到所述受试者中以使得所述一种或多种蛋白质提供给所述受试者。

5、在其它方面，本发明包括递送供体核酸到靶细胞。供体可以在编码核酸酶的核酸之前、之后或与其同时进行递送。在某些实施方案中，供体与核酸酶同时地递送。在其它实施方案中，供体是先于核酸酶，包括先于核酸酶任何时间，例如，紧接核酸酶前、先于核酸酶1至60分钟(或其间的任何时间)、先于核酸酶1至24小时(或其间的任何时间)、1至48小时(或其间的任何时间)或先于核酸酶48小时以上进行递送。在某些实施方案中，供体是在核酸酶之后(优选地，在4小时内)进行递送。供体核酸包含将被整合到细胞的基因组(例如内源基因座)中的外源序列(转基因)。转基因优选地在核酸酶切割位点或接近核酸酶切割位点(例如，在1至50个碱基对以内)进行整合。在一些实施方案中，供体包含侧悬与靶向切割位点同源的区域的全长基因或其片段。在一些实施方案中，供体缺少同源区且通过无关同源的机制(即nhej)整合到靶基因座中。在其它实施方案中，供体包含一更小段的侧悬用于细胞(即，用于基因修正)的同源区的核酸。在一些实施方案中，供体包含编码功能性或结构性组分诸如shrna、rnai、mirna或类似组分的基因。在其它实施方案中，供体包含编码结合到受关注的基因和/或调节受关注的基因的表达的调节元件的基因。

6、在其它方面，由病毒和/或非病毒基因转移方法递送供体。在优选的实施方案中，供体通过腺相关病毒(aav)递送到细胞。可以使用任何aav载体，包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8和其组合。在一些情况中，aav包含与衣壳血清型(例如，具有aav5、aav6或aav8衣壳的aav2 itr)比较而言的异源血清型的ltr。供体可以使用与递送核酸酶(包括位于相同载体上的)所用相同的基因递送系统递送或可以使用一不同的用于核酸酶的递送系统递送。在某些实施方案中，供体是使用病毒载体(例如，aav)来递送及核酸酶是呈mrna形式进行递送。

7、供体分子的受关注的序列可以包含一个或多个编码功能性多肽(例如，cdna)的含有或不含启动子的序列。在某些实施方案中，核酸序列包含编码抗体、抗原、酶、生长因子、受体(细胞表面或细胞核)、激素、淋巴细胞活素、细胞介素、受体、任何上述的功能性片段和上述的组合的序列。在功能性多肽编码序列是无启动子的实施方案中，经过整合的序列的表达则通过受关注的区域中的内源启动子或其它对照元件驱动转录得以确保。在其它实施方案中，“串接”盒如此地整合到所选位点中，所述盒的第一组分包含如上所述的无启动子序列，接着是转录终止序列，然后是编码自主表达盒的第二序列。额外的序列(编码或非编码序列)可以包含在位于同源臂(包括但不限于编码2a肽的序列、sa位点、ires等)之间的供体分子中。

8、另一方面，本文描述供体核酸通过同源性独立机制整合到细胞的基因组中的方法。所述方法包括在细胞的基因组中产生双链断裂(dsb)及使用核酸酶切割供体分子，使得供体核酸在dsb的位点得以整合。在某些实施方案中，供体核酸通过非同源性依赖方法(例如，nhej)进行整合。如上所述，在活体内切割后，供体序列可以用有针对性的方法在dsb的位置整合到细胞的基因组中。供体序列可以包含用于产生dsb的核酸酶中一种或多种核酸酶的相同靶位点中的一或多者。因此，供体序列可以由用于切割需要整合的内源基因的相同核酸酶中一种或多种核酸酶切割。在某些实施方案中，供体序列包含与用于引起dsb的核酸酶不同的核酸酶靶位点。可以通过任何机制产生靶细胞基因组中的dsb。在某些实施方案中，通过一种或多种锌指核酸酶(zfn)、包含经过工程改造以使序列结合于受关注的区域中的锌指结合域的融合蛋白和切割域或切割半域产生dsb。在其它实施方案中，通过一个或多个融合到核酸酶域(talen)的tale dna结合域(天然生成或非天然存在的)产生dsb。在其它实施方案中，使用经过工程改造的单导引rna或其功能性等效物视需要用于导引核酸酶到基因组中的靶位点的crispr/cas或ttago核酸酶系统产生dsb。

9、在其它方面，核酸酶与哺乳动物细胞中的安全港的基因(例如ccr5基因、ppp1r12c(也称为aavs1)基因、rosa基因或白蛋白基因)结合和/或将其切割。此外，为有助于哺乳动物系统中的选择，可以使用hprt基因座。

10、一方面，供体为与受关注的基因结合和/或调节受关注的基因的表达的受关注的调节蛋白(例如zfp tf、tale tf或crispr/cas tf)。在一个实施方案中，调节蛋白与dna序列结合并防止其它调节因子的结合。在另一实施方案中，调节蛋白的结合可以调节(即，引起或抑制)靶dna的表达。

11、在其它方面，本文提供一种已如本文所述例如使用核酸酶以引入基因修饰进行基因修饰(例如，转基因)的细胞。在某些实施方案中，由本文所述的方法制得所述细胞。在某些实施方案中，所述细胞包含整合到安全港基因座(诸如ccr5、aavs1、alb、rosa26和/或hprt)中的转基因。所述的包含所整合转基因的细胞可以从内源启动子表达转基因，或者，所述转基因可以包括调节元件和控制元件，诸如驱动转基因的表达(例如，当被整合到安全港基因座中时)的外源启动子。在某些实施方案中，所述的包含转基因的细胞不含任何被整合到基因组中的病毒载体序列。所述细胞可以是任何真核细胞，例如cd34+干细胞(例如，患者中通过粒细胞集落刺激因子(gcsf)或其它移动剂投与从骨髓移动进入周边血液中或直接从骨髓或脐带血收集得的源自患者的干细胞)。可以收获所述细胞，纯化，培养，且通过任一适合的方法将核酸酶和/或供体引入到所述细胞中。

12、还提供包含如本文所述的经过基因修饰的细胞的组合物诸如药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含cd34+hsc/pc或hsc/pc细胞群体。在其它实施方案中，所述组合物包含t细胞(例如cd4+和/或cd8+t细胞)。在其它实施方案中，所述t细胞组合物仅包含cd4+或仅包含cd8+细胞。

13、另一方面，提供使用如本文所述的经过基因修饰的细胞的方法。在某些实施方案中，经过基因修饰的血液细胞前体(“hsc/pc”)以骨髓移植提供且所述hsc/pc在活体内分化并成熟。在一些实施方案中，在g-csf引起的移动后分离得所述hsc/pc，及在其它实施方案中，从人骨髓或脐带分离得所述细胞。在一些方面，通过用经过设计以敲除特异性基因或调节序列的核酸酶处理来编辑所述hsc/pc。在其它方面，用经过工程改造的核酸酶和供体核酸修饰所述hsc/pc使得野生型基因或其它受关注的基因得以插入并表达和/或内源异常基因得以校正。在一些实施方案中，在温和的清髓预处理后向患者投与经过修饰的hsc/pc。在其它方面，完全清髓后投与所述hsc/pc以便随后的移植，造血细胞100％源自经过修饰的hsc/pc。而且，可以在细胞周期的g2阶段中将所述细胞阻滞。

14、在一些实施方案中，转基因hsc/pc细胞和/或动物包括编码人基因的转基因。在一些情况中，转基因动物包含内源基因座处对应于外源转基因的敲除基因，由此允许发展人蛋白质可以在分离中研究的活体内系统。这些转基因模型可以出于筛选目的而用于识别小分子或大生物分子或其它可修饰受关注的人蛋白质或与其相互作用的实体。在一些方面，将转基因整合到由本文所述的任何方法得到的干细胞(例如，胚胎干细胞、诱导型多潜能干细胞、造血干细胞或祖细胞等)或动物胚胎中的所选基因座(例如，安全港)中，且接着植入胚胎，因此，活的动物出生。然后将所述动物养到性成熟并让其产出后代，其中后代中的至少一些包含经过编辑的内源性基因序列或所整合的转基因。

15、还提供一种包括本发明的aav和核酸的试剂盒。所述试剂盒可以包括编码核酸酶的核酸(例如编码包含在适宜的表达载体中的基因的rna分子或zfn、talen、ttago或crispr/cas系统)、或核酸酶蛋白的等分部分、供体分子、适宜的干性改性剂、用于进行本发明方法的使用说明等。所述试剂盒还可以包括受关注的供体分子，诸如选择或筛选标记物。

16、本领域技术人员总体上根据公开内容当可轻易了解这些与其它方面。