一种生物合成人体结构性材料的制备方法与流程

本发明涉及一种生物，具体涉及一种生物合成人体结构性材料的制备方法。

背景技术：

1、人体结构性材料主要是包含胶原蛋白的结构性蛋白，这类蛋白对细胞、组织具有黏附、支撑功能，是主要的细胞外基质组成成分。

2、胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能，修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料所望尘莫及的良好的生物组织相容性，以及优异的对细胞的支撑弹性和可降解性，因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。

3、天然胶原蛋白分子可形成一种特殊的超螺旋结构，这种超螺旋结构是以3个氨基酸残基为基本重复体的左手螺旋，这三个氨基酸残基通常为gly-x-pro。其中，所述gly代表甘氨酸，x代表任意天然氨基酸，pro代表脯氨酸。gly对胶原蛋白中氢键的形成是必须的，它本身没有侧链因此能够使胶原蛋白紧密堆积，并且能维持皮肤张力和弹性。随着人们年龄的增长，真皮内的胶原蛋白发生降解和老化，皮肤变得干燥并出现皱纹。为防止皮肤衰老，有学者研究通过补充胶原蛋白来达到延缓皮肤衰老的进程。

4、生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。利用传统的生产胶原蛋白的方法制备得到的胶原蛋白不具有对应的生物活性，且存在由物种不同造成的免疫原性和活体动物自身携带的多种病毒污染，具有较大的安全风险。随着现代技术的发展，可通过基因工程技术生产重组胶原蛋白，通过该方法制备得到的重组胶原蛋白具有低免疫原性和较好的生物活性，可被广泛应用于生物医学各领域。但是如何从人胶原蛋白序列中选择出具有功能且能够大量表达用于规模化生产的氨基酸序列是目前我们所面临的困难。所以亟需一种可以克服该缺陷的重组iii型胶原蛋白的生物合成方法，使其可作为人体结构性材料得到广泛应用。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、本发明提供一种重组iii型胶原蛋白，并提供其生物合成的制备方法，及其在医药领域的用途，用以解决天然人iii型胶原蛋白在体外无法正确表达并大量制备的问题，为人源化胶原蛋白的生产应用提供新的可能。

3、用于解决问题的方案

4、本发明在第一方面提供了一种重组iii型胶原蛋白，其特征在于，所述重组iii型胶原蛋白的氨基酸序列包含n个重复序列，n为大于等于1的整数；其中，所述重复序列为人天然iii型胶原蛋白的功能区序列；

5、在一些优选的实施方案中，所述n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的；

6、在一些更优选的实施方案中，所述为4、8或16；

7、在一些最优选的实施方案中，所述重组iii型胶原蛋白的氨基酸序列包含如下(i)～(iii)中的任一项：

8、(i)如seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9、seqid no.11、seq id no.13、seq id no.15、seq id no.17、seq id no.19或seq id no.21所示的氨基酸序列；

9、(ii)在如seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9、seq id no.11、seq id no.13、seq id no.15、seq id no.17、seq id no.19或seq idno.21所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或修饰1个或多个氨基酸残基并且保留人天然iii型胶原蛋白的细胞黏附效果的氨基酸序列；

10、(iii)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9、seq id no.11、seq id no.13、seqid no.15、seq id no.17seq id no.19或seq id no.21所示序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留人天然iii型胶原蛋白的细胞黏附效果，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

11、在一些具体的实施方案中，本发明在第一方面中所述的重组iii型胶原蛋白的氨基酸序列中包含能够通过tev蛋白酶切除的氨基酸序列，所述能够通过tev蛋白酶切除的氨基酸序列如seq id no.23所示；

12、在一些优选的实施方案中，所述能够通过tev蛋白酶切除的氨基酸序列与所述重复序列直接连接；

13、在一些更优选的实施方案中，所述能够通过tev蛋白酶切除的氨基酸序列位于所述重组iii型胶原蛋白的n末端。

14、本发明在第二方面提供了一种编码本发明在第一方面中所述的重组iii型胶原蛋白的多核苷酸；

15、在一些优选的实施方案中，所述多核苷酸的序列包含如seq id no.2、seq idno.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.12、seq id no.14、seq idno.16、seq id no.18、seq id no.20或seq id no.22所示的序列。

16、本发明在第三方面提供了一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如本发明在第二方面中所述的多核苷酸；

17、在一些优选的实施方案中，所述重组表达载体包括pet系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体；

18、在一些更优选的实施方案中，所述重组表达载体为pet-32a。

19、本发明在第四方面提供了一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含本发明在第三方面中所述的重组表达载体；

20、在一些优选的实施方案中，所述重组宿主细胞为原核细胞、酵母或真核细胞；

21、在一些更优选的实施方案中，所述重组宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。

22、本发明在第五方面提供了本发明在第一方面中所述的重组iii型胶原蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

23、s1：发酵培养根据本发明在第四方面中所述的重组宿主细胞，诱导蛋白表达；

24、s2：收集所述蛋白；

25、s3：纯化所述蛋白；在一些优选的实施方案中，包括使用ni亲和层析柱和/或离子交换层析柱纯化所述蛋白。

26、在一些具体的实施方案中，在所述s1步骤中，所述发酵培养在转速为200～240rpm、温度为35～38℃的摇床中进行；在一些优选的实施方案中，所述发酵培养在转速为220rpm、温度为37℃的摇床中进行。

27、在另外一些具体的实施方案中，在所述s1步骤中，所述诱导蛋白表达的具体操作为：在放大培养的菌液中添加iptg并降温至16℃；在一些优选的实施方案中，所述iptg的终浓度为0.3～0.7mm；在一些更优选的实施方案中，所述iptg的终浓度为0.5mm。

28、在一些具体的实施方案中，在所述s2步骤中，所述收集所述蛋白的具体操作为：将s1步骤所得到的菌体用含有20-30mm tris、150～250mm氯化钠和15～25mm咪唑的平衡工作液重悬，将菌液温度降温至4～15℃，高压均质后于4℃环境下15000～18000rpm离心20～40min。

29、本发明在第六方面提供了本发明在第一方面中所述的重组iii型人源化胶原蛋白在制备产品中的用途，所述产品包括医疗器械、化妆品、保健品或药物。

30、发明的效果

31、本发明提供了多种包含人iii型胶原蛋白功能区氨基酸序列的重组iii型胶原及其制备方法，并测试了所述重组iii型胶原蛋白的蛋白表达量和收率情况。

32、通过以上技术方案的实施，本发明提供了能够在体外正确表达的重组iii型胶原蛋白的氨基酸序列，并且成功在体外进行了生物合成，该蛋白的氨基酸序列源于天然人iii型胶原蛋白，用于人体不会产生不良免疫反应。同时，本发明提供的重组iii型胶原蛋白的制备方法简单，在低成本下即可获得较高产量的重组iii型胶原蛋白。