一类基于环状脂肽Brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽及其应用

本发明属于生物化学，涉及一类通过改变brevicidine脂肽正电荷的种类及数量得到的低毒高稳定性抗菌肽，本发明同时还涉及该类抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。

背景技术：

1、多重耐药细菌病原体(主要包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌)的迅速出现和传播对全球医疗构成了严重威胁(nature.2017；543(7643):15)。据估计，全球每年有70万人死于抗生素耐药性问题，一些专家预测，如果不努力减小细菌耐药性或开发新的抗生素，到2050年，这一数字可能会上升到1000万(infect control hosp epidemiol.2019；40(1):112-113)。

2、抗菌肽广泛分布于自然界，是生物体先天免疫系统的重要组成部分，也被称为宿主防御肽(j mol biol.2019；431(18):3547-3567)。大量的研究发现，由于非特异性的膜渗透机制，抗菌肽能够快速杀死细菌而不产生耐药性，同时具有广谱抗菌活性，而传统的抗生素大多与特定的靶标相互作用，容易产生耐药性(biomed res int.2016；2016:2475067)。因此，抗菌肽在开发潜在的抗菌药物以取代传统抗生素方面备受关注。

3、与在核糖体上遗传编码和合成的天然存在的抗菌肽相比，天然存在的脂肽是一类非核糖体合成的、结构多样的抗生素，其n末端与长链脂肪酸结合。目前临床使用的脂肽类抗生素主要有多黏菌素b和达托霉素(chembiochem.2009；10(4):607-16)。2018年香港大学的yong-xin li等人通过基因组挖掘从侧孢短芽孢杆菌dsm 25中发现了一种环状脂肽brevicidine(bre)，对革兰氏阴性菌有特异性杀伤作用，由于序列中的d型氨基酸，非天然氨基酸和环状结构，稳定性高，具有良好的发展前景(nat commun.2018；9(1):3273)。但体外合成方法复杂、生产成本高、产率低等缺点限制了此类环状脂肽抗生素的进一步应用。在此基础上，申请人对环状脂肽brevicidine进行结构改造，以期得到合成简便、产率高、低毒稳定的抗菌肽。

技术实现思路

1、本发明的目的之一：提供一类基于环状脂肽brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽及其应用。

2、本发明的目的之二：提供上述抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。

3、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、(一)一类基于环状脂肽brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽的结构设计

5、本发明提供的一类基于环状脂肽brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽，是将环状脂肽brevicidine进行正电荷种类、数量的改变得到；

6、所述正电荷种类的改变是指，将环状脂肽brevicidine的4,5,7位的3个鸟氨酸(orn)用精氨酸(r)取代，得到环状抗菌肽1，其氨基酸序列为c7h13o-n(d)-y(d)-w(d)-arg(d)-arg-g-arg(d)-w-cyclo[t-i-g-s]；

7、所述正电荷数量的改变是指，将环状脂肽brevicidine的1位的天冬氨酸(n)，6位的甘氨酸(g)分别用鸟氨酸(orn)取代，得到2个母肽brevicidine增加一个正电荷的环状抗菌肽2和抗菌肽3，其氨基酸序列分别为：

8、c7h13o-orn(d)-y(d)-w(d)-orn(d)-orn-g-orn(d)-w-cyclo[t-i-g-s]，

9、c7h13o-n(d)-y(d)-w(d)-orn(d)-orn-orn-orn(d)-w-cyclo[t-i-g-s]。

10、所述环状脂肽brevicidine的氨基酸序列如下：

11、c7h13o-n(d)-y(d)-w(d)-orn(d)-orn-g-orn(d)-w-cyclo[t-i-g-s]。

12、作为本发明技术方案的进一步改进，所述抗菌肽是将抗菌肽2的n末端的4-甲基己酸用正癸酸取代，并将9位苏氨酸(t)和12位丝氨酸(s)处形成的羧基断开，记为抗菌肽4，为线性抗菌肽，其氨基酸序列为c10h19o-orn(d)-y(d)-w(d)-orn(d)-orn-g-orn(d)-w-t-i-g-s。

13、(二)一类基于环状脂肽brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽的合成

14、本发明一类基于环状脂肽brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽，以二氯树脂为原料，采用固相-液相结合的方法合成环状抗菌肽；以mbha树脂为原料，采用固相合成法合成线性抗菌肽。

15、(三)一类基于环状脂肽brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用

16、1、体外抑菌实验

17、采用经典的微量连续二倍稀释法测定本发明抗菌肽对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度(mic)。以抗生素polymyxin b作为阳性对照，结果见表1。

18、表1本发明抗菌肽对常见标准菌株的最低抑菌浓度

19、

20、表1结果显示，母肽brevicidine仅对革兰氏阴性菌具有抑制作用，本发明抗菌肽1，2，3，4保持了母肽对革兰氏阴性菌的抑制作用，其中抗菌肽4对革兰氏阳性菌也有抑制作用，表现为广谱抗菌活性。

21、2、溶血活性实验

22、为了考察本发明合成的抗菌肽对正常哺乳动物细胞的毒性，申请人测定了母肽brevicidine及本发明抗菌肽与小鼠红细胞孵育1h后的溶血情况，结果见图6。

23、图6结果显示，母肽brevicidine和抗菌活性良好的抗菌肽1，2，3，4在128μm时均没有表现出溶血活性，表明溶血毒性低，安全性高。

24、3、盐离子稳定性实验

25、生理盐干扰抗菌肽与细菌膜之间的静电相互作用，从而影响抗菌肽的抗菌活性。为了探究正电荷的种类及数量对抗菌肽盐离子稳定性的影响，申请人测定了母肽brevicidine及本发明抗菌肽在不同浓度的盐离子溶液存在下对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的mic值。

26、如表2，表3所示，母肽brevicidine及本发明抗菌肽1，2，3，4在不同浓度的盐离子溶液中对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌保持良好的抗菌活性，mic不变或者增大1-8倍。

27、表2本发明抗菌肽在盐离子溶液中对金黄色葡萄球菌的mic

28、

29、表3本发明抗菌肽在盐离子溶液中对铜绿假单胞菌的mic

30、

31、本发明相较于现有技术的有益效果为：

32、1、本发明一类基于环状脂肽brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽由母肽brevicidine改造而来，相较于母肽brevicidine，本发明抗菌肽1，2，3，4对革兰氏阴性菌的抑制作用与brevicidine相当，而对革兰氏阳性菌的抑制作用都比brevicidine强，其中抗菌肽4表现出明显的广谱抗菌活性。

33、2、本发明一类基于环状脂肽brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽1，2，3，4在128μm时均没有表现出溶血活性，表明溶血毒性低，安全性高。

34、3、本发明抗菌肽4合成过程中，用正癸酸替换4-甲基己酸，原料廉价易得，制备成本更低。此外，相较环状母肽brevicidine而言，本发明的线性抗菌肽4合成方法简单，产率更高。

35、综上，本发明提供的一类基于环状脂肽brevicidine合成的低毒高稳定性抗菌肽在制备临床抗菌药物中具有很好的应用前景。