一种从膜锚定表达PGE-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法及其应用

本发明涉及医药，具体涉及一种从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法及其应用。

背景技术：

1、肝纤维化是一种以肝细胞损伤后生成永久性斑痕为特征，并伴随着高死亡率的严重疾病，通常是由于严重的外部创伤、自发免疫反应、病毒性肝炎和药物不良副反应等因素引起。研究表明，肝纤维化的进程大致分为3个阶段：第一阶段，肝脏受到损伤或其他有害刺激，肝星型细胞由静止状态转变为激活状态，从而引起成纤维细胞的激活，导致细胞外基质(ecm)产生过多；第二阶段，活化的ecm发生肝小叶等结构的重造，同时t细胞以及肝内巨噬细胞被激活，产生各种细胞因子；第三阶段，损伤因素持续存在，成纤维细胞继续被激活，产生更多的ecm，细胞因子持续不断的引起组织炎症和胶原过度表达，ecm不断沉积，形成瘢痕组织，肝纤维化逐渐形成，最终导致肝硬化和肝功能丧失。

2、近些年，虽然随着技术手段的进步，肝纤维化的治疗药物的研究取得了一定进展，但是由于其发病机理尚未完全阐释清楚，所以尚且缺乏有效的治疗方法。目前，肝维化的主要治疗策略有：抗炎、抗纤维化和抗氧化等，治疗手段主要有药物治疗、手术治疗、肝移植等。但是，药物治疗具有较大的副作用，而肝移植作为目前治疗肝纤维化最有效的手段，则由于捐献器官资源缺乏、排斥反应、感染、并发症和费用昂贵等缺陷，限制了其应用。

3、干细胞疗法近年发展迅速，其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是应用于组织再生及临床转化治疗的理想种子细胞。mscs的来源广泛，以骨髓和脂肪来源最为常见。然而，这些目前应用的mscs普遍存在以下问题：①提取需要侵入性的技术，如骨髓穿刺、脂肪提取等，对供者是一种打击；②大多已经商品化，但是由于供体不同，每一株mscs的基因组以及遗传背景也不一样，导致种子细胞具有不均一性，对于需要进行多次移植mscs进行治疗的患者来说，治疗效果可能无法达到预期，并且存在一定遗传突变的风险；③原代mscs的增殖能力随着体外培养时间的增长，受限于增殖速度以及传代培养过程中出现的衰老凋亡，无法应对突发情况下种子细胞数量不足的情况；④mscs中基因编辑效率低下。因此，以上瓶颈问题大大的限制了mscs在精准医疗中的应用，这就促使人们去寻找新的mscs种子细胞来源。人胚胎干细胞(hesc)虽然具有无限自我更新以及分化潜能，但由于其免疫原性等问题，导致其在临床上的使用有较大的限制，因此鲜少有其用于抗肝纤维化的报道。

技术实现思路

1、本发明目的在于针对目前用于抗纤维化的干细胞疗法中的间充质干细胞(mscs)所存在的提取需要侵入性的技术，增殖能力有限以及培养传代的分化能力受损使其功能也随着供体的年龄增长而下降，造成疗效受到限制等技术问题，提供了一种从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法及其应用。

2、本发明所采用的技术方案如下：

3、一种从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)制备膜锚定pge-2过表达hesc细胞系hescoe-pge-2；

5、(2)hescoe-pge-2细胞分化为hesc-mscsoe-pge-2细胞。

6、进一步的，以上所述的从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法，步骤(1)包括以下步骤：

7、s1.通过克隆技术构造膜锚定表达的pge-2克隆载体并进行慢病毒包装，得到膜锚定过表达pge-2的慢病毒；

8、s2.对胚胎干细胞进行膜锚定过表达pge-2的慢病毒感染；

9、s3.通过流式分选得到稳定膜锚定表达的hescoe-pge-2细胞系。

10、进一步的，以上所述的从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法，步骤(2)包括以下三个阶段：

11、第一阶段，移除滋养层细胞并在matri-gel包被的细胞培养皿中进行hescoe-pge-2细胞培养，培养体系中去除matri-gel包被条件，诱导hescoe-pge-2细胞的自我分化；

12、第二阶段，用胰蛋白酶将分化的hescoe-pge-2细胞消化成单个细胞并进行培养，促使间充质干细胞样的细胞增殖；

13、第三阶段，每隔一天进行细胞传代，以富集间充质干细胞样细胞，高度富集的间充质干细胞样细胞通过流式细胞分选的方法将标记为cd24-/cd105+的msc细胞进行分选纯化，并在96孔培养板中进行单克隆培养，扩增msc细胞，建立hesc-mscsoe-pge-2系。

14、更进一步的，以上所述的从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法，第一阶段中的诱导时间为3天。

15、更进一步的，以上所述的从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法，第二阶段中的培养增殖时间为4天。

16、更进一步的，以上所述的从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法，第二阶段进行培养所用培养基的组份包括：rpmi-1640(基础培养基)、20％kosr(基因敲除血清替代培养基)、10ng/mlbfgf(基础成纤维细胞生长因子)、20ng/mlpdgfab(血小板衍生生长因子ab)、10ng/ml egf(表皮生长因子)。

17、更进一步的，以上所述的从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的制备方法，第三阶段培养时间为7-14天。

18、如权利要求1所述的从膜锚定表达pge-2的胚胎干细胞分化来源的间充质干细胞的应用，为在制备抗肝纤维化药物中的应用。

19、本发明的有益效果在于：

20、1.本发明中的hesc-mscsoe-pge-2无需进行侵入性的提取，克服了目前应用的mscs提取需要侵入性技术的问题，大大减少了供者的痛苦。

21、2.本发明中的hesc-mscsoe-pge-2分化来源于同一株具有均一和稳定基因组的hesc，能更好的进行种子细胞质控和在一定程度上避免发生基因突变，克服了目前应用的mscs存在的种子细胞具有不均一性，治疗效果无法达到预期并且存在一定遗传突变风险等问题，提高了细胞应用的安全性。

22、3.本发明中的hesc-mscsoe-pge-2的增殖潜能强于mscs，在本发明中均可扩增至50代以上，并且可以分化出一定基数的种子细胞后再进行大量扩增，极大地提高了细胞的储备，克服了目前应用的mscs存在的增殖速度限制以及传代培养过程中出现的衰老凋亡，无法应对突发情况下种子细胞数量不足的问题。

23、4.本发明中的hesc-mscsoe-pge-2是利用基因编辑技术使其膜锚定持续表达pge-2，克服了目前应用的mscs基因编辑效率低下的问题，达到精准治疗的目的，并且大大提升了抗肝纤维化的治疗效果。

24、5.本发明制备方法通过添加egf、bfgf等生长因子，将hesc分化为mscs(hescderived mscs，hesc-mscs)，作为msc种子细胞的重要来源，解决了胚胎干细胞的免疫原性的限制问题。

25、6.本发明制备方法具有无创性获得种子细胞以及种子细胞具有可编辑性、可重复性、稳定性好等优点。