一种胞内蛋白递送和核酸转染的通用型聚合物载体

本发明涉及高分子化学和生物，具体涉及一种胞内蛋白递送和核酸转染的通用型聚合物载体。

背景技术：

1、蛋白质是细胞生化反应和功能的关键调控因子，可以调节细胞内的很多生理过程，其在细胞内组分含量占60％左右，因此利用蛋白质药物去调节细胞内的生化反应是非常关键的。作用于胞内靶点的蛋白质药物可以有效治疗不同疾病，可以解决细胞内靶点不可成药的问题。具体来讲，蛋白质药物可以实现基因编辑、诱导细胞毒性以及调控信号通路等一系列生理功能。

2、但是由于蛋白质分子量非常大，亲水性强，同时还非常不稳定，在体内容易被蛋白酶降解，导致蛋白质无法独立地渗透细胞膜进入细胞发挥作用。

3、基因治疗是将外源核酸导入细胞，代替或修改细胞内缺陷基因的表达，或是表达特定功能蛋白质，调控细胞的生物学活动，从而达到治疗疾病的目的。但由于核酸分子量大、带有负电且亲水性高，难以直接被细胞摄取。

4、目前，多种递送系统已被开发并应用于蛋白质和核酸的胞内递送，如囊泡、聚合物纳米颗粒、基于脂质的纳米载体、细胞穿透肽和无机纳米颗粒。然而，现有载体普遍存在递送效率较低、细胞毒性大、通用性差等共性问题。因此，本领域迫切需要开发一种高效、安全、通用的胞内蛋白递送和核酸转染的载体。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明提供了一种胞内蛋白递送和核酸转染的通用型聚合物载体及其制备方法与应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个方面，在于提供了一种胞内蛋白递送和核酸转染的通用型聚合物载体，所述通用型聚合物载体包括两种结构，其一由中性聚合物、阳离子聚电解质和苯硼酸功能基团组成，如式ⅰ所示，所述阳离子聚电解质和苯硼酸功能基团通过可逆加成-断裂链转移连接在中性聚合物上；其二由阳离子聚电解质和苯硼酸功能基团组成，如式ⅱ所示：

4、a-b-[(b)x-co-(c)y]        式ⅰ

5、(b)x-co-(c)y          式ⅱ

6、其中，a表示中性聚合物；b表示阳离子聚电解质；c表示苯硼酸功能基团；-co-表示无规共聚物；-b-表示嵌段共聚物；

7、x为阳离子聚电解质的聚合度，选自10-100中的任一整数；

8、y为苯硼酸功能基团的聚合度，选自10-100中的任一整数。

9、进一步地，所述中性聚合物选自聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、聚甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱、聚3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯和聚3-[(3-丙烯酰胺基丙基)二甲基铵]丙酸盐中的一种或多种。

10、进一步地，所述阳离子聚电解质结构如式ⅲ所示：

11、

12、式ⅲ中，r1表示-h或-ch3；

13、r2表示-c(＝o)-nh-、-c(＝o)-o-或-c6h4-；

14、r3表示-nh2、-nh-ch3、-n-(ch3)2、-n+-(ch3)3或-nh-c(＝nh)-nh2；

15、n为1-3之间的整数。

16、进一步地，所述苯硼酸功能基团的结构如式ⅳ-ⅵ所示：

17、

18、

19、式ⅳ-ⅵ中：

20、r1表示-h或-ch3；

21、r2表示连接键；

22、r3、r4、r5、r6为化学官能团，分别独立地选自h、卤素、c1-c5烷基、c1-c5甲氧基和硝基中的一种。

23、进一步地，所述通用型聚合物载体的链长范围在20-267之间。

24、本发明的第二个方面，在于提供了所述胞内蛋白递送和核酸转染的通用型聚合物载体的制备方法，包括如下步骤：

25、(1)向史莱克瓶中加入一定量的中性聚合物-链转移剂或链转移剂、阳离子聚电解质、苯硼酸功能基团和引发剂，充分搅拌混合；

26、(2)引发聚合得到通用型聚合物载体粗产物；

27、(3)除去粗产物中的引发剂、未反应的阳离子聚电解质和苯硼酸功能基团，得到通用型聚合物载体。

28、进一步地，所述步骤(1)中的中性聚合物-链转移剂的制备步骤如下：称取一定量的中性聚合物、链转移剂和4-二甲基氨基吡啶搅拌溶解，再加入n,n-二环己基碳二亚胺，充分混合搅拌，反应后得到粗产物，经过滤、沉淀和烘干后，得到中性聚合物-链转移剂。

29、进一步地，所述链转移剂选自甲基(苯基)氨基二硫代甲酸氰甲酯、s-氰甲基-s-十二基三硫代碳酸盐、二硫代苯甲酸氰基异丙酯、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸、s-(2-氰基-2-丙基)-s-十二烷基三硫代羰基酯、4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸和2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸中的一种或多种。

30、进一步地，所述阳离子聚电解质的物质的量为0.001-100mmol；所述苯硼酸功能基团的物质的量为0.001-100mmol；所述引发剂的添加量为阳离子聚电解质与苯硼酸功能基团的质量之和的0.1-10wt％。

31、进一步地，所述引发剂为光引发剂或热引发剂，所述热引发剂选自偶氮二异丁腈和过硫酸盐中的一种；所述光引发剂选自2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂中的一种。

32、进一步地，所述步骤(2)为光引发剂在紫外灯光照下引发聚合1-12小时。

33、进一步地，所述步骤(2)为热引发剂在60-80℃下引发聚合1-24小时。

34、进一步地，所述步骤(3)中使用去离子水超滤、离心或透析除去粗产物中的引发剂、未反应的阳离子聚电解质和苯硼酸功能基团。

35、本发明的第三个方面，在于提供了所述胞内蛋白递送和核酸转染的通用型聚合物载体的应用，用于向细胞中递送蛋白和转染核酸。

36、进一步地，所述细胞选自hela细胞、人脐静脉内皮细胞、人肝癌细胞、非洲绿猴肾成纤维细胞、人肺癌细胞、小鼠胚胎成纤维细胞和人乳腺癌细胞中的一种。

37、进一步地，所述蛋白选自胃蛋白酶、牛血清白蛋白、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、细胞色素c和溶菌酶中的一种；所述核酸选自小干扰rna(sirna)、信使rna(mrna)和质粒(pdna)中的一种。

38、本发明的胞内蛋白递送和核酸转染的通用型聚合物载体具如下有益效果：

39、1、本发明的通用型聚合物载体可以高效负载多种蛋白质药物分子和核酸分子，通用性好，同时能有效保持蛋白质和核酸的结构和生物活性，递送效率高、细胞毒性低、操作便捷，性能明显优于市售转染试剂。

40、2、本发明的通用型聚合物载体对生理条件下的胃蛋白酶、牛血清白蛋白、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、细胞色素c、溶菌酶、sirna、mrna和pdna等都具有很高的递送和转染效率，是一个高效、通用的胞内蛋白递送和核酸转染平台，在非病毒载体方面具有潜在的体外转染及临床应用价值。

41、3、本发明的通用型聚合物载体的细胞毒性低，在胞内蛋白递送和核酸转染的实验条件下细胞的存活率高于90％，具有很高的安全性和生物相容性。并且当通用型聚合物载体中加入中性聚合物时，可以大大弱化复合物表面的正电荷，降低细胞毒性。