检测棘白菌素及三唑类耐药的念珠菌的组合物、方法及应用

本发明属于真菌检测，具体涉及一种检测棘白菌素及三唑类耐药的念珠菌的组合物、方法及应用。

背景技术：

1、侵袭性真菌病(invasive fungal disease,ifd)是指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖导致组织损害、器官功能障碍和炎症反应的病理改变及病理生理过程。近年来，随着免疫受损人群的不断增加，侵袭性真菌病的发病率逐年上升，其中最常见的是侵袭性念珠菌病。常见的治疗侵袭性念珠菌病的药物有棘白菌素、三唑类抗真菌药如伊曲康唑、氟康唑、泊沙康唑等，治疗念珠菌的抗真菌药物非常有限。并且随着耐药菌的不断出现，死亡率逐渐增加。

2、为了更好地选择有效的治疗药物，需要对耐药菌进行快速检测。然而耐药菌株的分子检测方法有限，目前实验室主要的方法是基于培养阳性获得菌株后，进行体外药敏试验，确定耐药菌株，进一步提取dna对耐药相关基因进行pcr扩增结合sanger测序。然而，培养的阳性率较低、体外药敏试验耗时较长、检测方法较繁琐等问题限制了耐药菌快速准确的检出，甚至耽误正确的治疗。因此，亟需建立一种准确、快速、灵敏的耐药真菌分子检测方法。

3、对于各类治疗念珠菌的抗真菌药物的耐药机制，本领域技术人员已多有研究。棘白菌素的耐药机制主要是靶酶编码基因fks热点区的突变。研究表明，棘白菌素耐药的白念珠菌有90％均由fks1的s641和s645位点突变导致，88％光滑念珠菌由fks1、fks2的几个热点突变导致；耳念珠菌的棘白菌素耐药也主要由fks1的热点突变介导。可见通过对fks热点突变的检测从而检测棘白菌素耐药菌株的方法是可行的。baslashov等人最先用多重分子信标(molecular beacon，mb)real-time pcr检测白念珠菌fks1的s645突变。zhao等人利用多重mb和熔解曲线的方法检测光滑念珠菌fks1和fks2的多个热点突变，能够在3小时内完成检测且准确率高达100％。念珠菌三唑类耐药的机制则更为复杂，除了erg11点突变外，主要还包括erg11过表达、外排泵过表达、转录因子突变等机制。而烟曲霉三唑类耐药主要由靶酶cyp51a突变导致，据此研发的检测方法也相对较多。baslashov等人首先利用多重mbreal-time pcr检测cyp51a第54位的突变，随后多重mb和taqman探针相继用于多个突变位点的检测。基于多重real-time pcr的商品化检测试剂盒aspergenius(pathonostics)能够有效检测出tr34，l98h，y121f，t289a突变，并成功用于balf等临床样本的直接检测。然而，上述方法中只有aspergenius评价了对于检测耐药菌和敏感菌混合时的检测能力，结果显示该方法在耐药菌：敏感菌比例低于1:5时即检测不到。

4、近年来随着真菌感染的不断增多、广谱抗菌药的使用以及检测技术的进步，不同菌种的混合感染甚至敏感菌和耐药菌的混合感染越来越多。然而，传统的药物敏感性检测方法需要在培养阳性的基础上，且需要分离纯化混合的不同菌株，若在耐药菌的比例较低的情况下，很难检测到耐药菌的存在，导致不敏感药物的使用，加速耐药菌优势群的形成，延误病情。

5、位点特异封闭实时定量pcr(allele-specific blocker real-time pcr，asbreal-time pcr)是一种能有效检测出snp、indel的方法，具有敏感度高、需要的模板量少、检测速度快、能够在野生模板中检测到突变模板等特点。该方法最先用于肿瘤的诊断，能够在大量野生型组织中检测到含有突变的肿瘤细胞，灵敏度极高，能在突变细胞仅含0.1％时被检测到，并且适用于福尔马林包埋-石蜡固定的肿瘤组织样本的检测。

6、目前用于检测耐药真菌的技术研究较少，cn113249452a专利公开了一种检测白念珠菌棘白菌素类耐药突变靶点的引物探针组合及其应用，主要包括用于检测突变位点f641s、s645p和r1361h的引物和探针，然而该方法难以实现三唑类耐药念珠菌的检测。并且现有检测方法很难检测敏感菌和耐药菌的混合感染。在前期研究中，我们将该方法应用到三唑类耐药的烟曲霉检测中，并且可以在敏感和耐药菌株混合感染时有效检出其中的耐药菌株。然而，检测耐药念珠菌尤其是光滑念珠菌和耳念珠菌的方法以及能够检测的突变位点比较局限，难度更大。

技术实现思路

1、基于前期真菌监测工作中发现的棘白菌素耐药念珠菌的fks突变和三唑类耐药念珠菌的erg11、pdr1突变，本发明利用asb real-time pcr原理设计特异性引物和探针，建立一种可以有效检测并在敏感和耐药菌株混合感染时有效检测出耐药菌株的快速分子检测方法，以解决临床中耐药菌检出率低、检测时间长、难以检测敏感菌和耐药菌混合感染的问题。

2、本发明的目的之一在于提供一种用于检测棘白菌素和/或三唑类耐药的念珠菌的组合物，本发明利用asb real-time pcr技术，设计了突变位点特异性引物以及野生位点特异的封闭探针，为棘白菌素及三唑类耐药的念珠菌的定性和定量检测提供了技术支持。

3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、用于检测棘白菌素和/或三唑类耐药的念珠菌的组合物，所述念珠菌包括光滑念珠菌和/或耳念珠菌；所述组合物为如下引物探针组合中的任一种或多种：

5、(1)组合一：包含用于检测光滑念珠菌pdr1-y682c位点的引物对a、探针a和封闭寡核苷酸a；所述引物对a包含核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物a和seq id no.2所示的反向引物a，所述探针a的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述封闭寡核苷酸a的核苷酸序列如seq id no.4所示；

6、(2)组合二：包含用于检测光滑念珠菌pdr1-i380l位点的引物对b、探针b和封闭寡核苷酸b；所述引物对b包含核苷酸序列如seq id no.5所示的正向引物b和seq id no.6所示的反向引物b，所述探针b的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述封闭寡核苷酸b的核苷酸序列如seq id no.8所示；

7、(3)组合三：包含用于检测光滑念珠菌pdr1-g346d位点的引物对c、探针c和封闭寡核苷酸c；所述引物对c包含核苷酸序列如seq id no.9所示的正向引物c和seq id no.10所示的反向引物c，所述探针c的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述封闭寡核苷酸c的核苷酸序列如seq id no.12所示；

8、(4)组合四：包含用于检测光滑念珠菌pdr1-g1099d位点的引物对d、探针d和封闭寡核苷酸d；所述引物对d包含核苷酸序列如seq id no.13所示的正向引物d和seq idno.14所示的反向引物d，所述探针d的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述封闭寡核苷酸d的核苷酸序列如seq id no.16所示；

9、(5)组合五：包含用于检测光滑念珠菌fks2-s663p位点的引物对e、探针e和封闭寡核苷酸e；所述引物对e包含核苷酸序列如seq id no.17所示的正向引物e和seq id no.18所示的反向引物e，所述探针e的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述封闭寡核苷酸e的核苷酸序列如seq id no.20所示；

10、(6)组合六：包含用于检测耳念珠菌erg11-y132f位点的引物对f、探针f和封闭寡核苷酸f；所述引物对f包含核苷酸序列如seq id no.21所示的正向引物f和seq id no.22所示的反向引物f，所述探针f的核苷酸序列如seq id no.23所示，所述封闭寡核苷酸f的核苷酸序列如seq id no.24所示；

11、(7)组合七：包含用于检测耳念珠菌fks1-s639f位点的引物对g、探针g和封闭寡核苷酸g；所述引物对g包含核苷酸序列如seq id no.25所示的正向引物g和seq id no.26所示的反向引物g，所述探针g的核苷酸序列如seq id no.27所示，所述封闭寡核苷酸g的核苷酸序列如seq id no.28所示。

12、进一步，所述探针a、探针b、探针c、探针d、探针e、探针f和探针g的5’端标记fam，3’端标记mbg。

13、进一步，所述封闭寡核苷酸a、封闭寡核苷酸b、封闭寡核苷酸c、封闭寡核苷酸d、封闭寡核苷酸e、封闭寡核苷酸f和封闭寡核苷酸g的3’端连接po4。

14、进一步，位点特异性引物的tm值比pcr延伸温度低10℃。

15、进一步，所述封闭寡核苷酸与位点特异性引物在同一条链上；所述封闭寡核苷酸的3’端磷酸化以阻止野生型模板扩增；所述封闭寡核苷酸的tm值约等于，但不能超过pcr延伸温度。

16、本发明的目的之二在于提供一种利用前述组合物定性鉴别棘白菌素和/或三唑类耐药中的念珠菌的方法，该方法可以实现棘白菌素及三唑类耐药中的光滑念珠菌和耳念珠菌的定性，尤其是可以在敏感和耐药菌株混合感染时检测出其中的耐药念珠菌。

17、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

18、利用前述组合物定性鉴别棘白菌素和/或三唑类耐药中的念珠菌的方法，包括以下步骤：

19、s1：提取样本中真菌dna；

20、s2：以s1所得真菌dna为模板，利用前述组合物进行实时荧光定量pcr，得到扩增曲线，判断待测样本中是否含有耐药念珠菌。

21、进一步，s2中，扩增反应程序为：第一阶段：50℃2min，95℃10min，1个循环；第二阶段：95℃15s，60℃1min，40个循环；反应体系为：dna模版1μl，taqpath proamp master mix10μl，正向引物1μl，反向引物1μl，探针0.5μl，封闭寡核苷酸4μl，无核酸酶水补至20μl。

22、进一步，所述正向引物、反向引物、探针、封闭寡核苷酸的浓度均为10μm；所述封闭寡核苷酸的工作浓度为位点特异性引物的4倍。

23、进一步，若所述实时荧光定量pcr得到扩增曲线且ct值≤35，判定为耐药念珠菌阳性；若无扩增曲线或ct值＞35，判定为耐药念珠菌阴性。

24、本发明的目的之三在于提供一种基于前述方法定量测定棘白菌素和/或三唑类耐药的念珠菌的菌载量的方法。

25、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

26、基于前述方法定量测定棘白菌素和/或三唑类耐药的念珠菌的菌载量的方法，待测样品利用前述的方法进行检测，得到ct值；将所述ct值代入靶点基因对应标准曲线的线性方程，计算耐药菌的菌载量。

27、进一步，在10-106个孢子/反应线性范围内，所述耐药念珠菌包括光滑念珠菌和/或耳念珠菌；所述耳念珠菌erg11-y132f的线性方程为y＝-3.3569x+37.962；所述光滑念珠菌pdr1-y682c的线性方程为y＝-3.6112x+36.902；所述光滑念珠菌pdr1-g1099d的线性方程为y＝-3.1197x+35.782；所述光滑念珠菌pdr1-g346d的线性方程为y＝-2.6826x+34.402；所述光滑念珠菌pdr1-i380l的线性方程为y＝-3.6439x+42.522；所述光滑念珠菌fks2-s663p的线性方程为y＝-3.1340x+40.116；所述耳念珠菌fks1-s639f的线性方程为y＝-3.9855x+41.829；其中，y为ct值，x为每个反应孔对应的孢子量的lg值。

28、本发明的目的之四在于提供一种前述组合物在制备用于检测混合感染中的耐药念珠菌的试剂或试剂盒中的应用，所述混合感染为耐药念珠菌和敏感念珠菌的混合感染。

29、该组合物可以在敏感和耐药菌株混合感染时有效检出其中的耐药光滑念珠菌和耐药耳念珠菌，且灵敏度高，检测限低。

30、作为优选，所述耐药念珠菌为棘白菌素和/或三唑类耐药的光滑念珠菌和/或耳念珠菌，所述敏感念珠菌为棘白菌素和/或三唑类敏感的光滑念珠菌和/或耳念珠菌。

31、本发明的目的之五在于提供一种用于检测棘白菌素和/或三唑类耐药的念珠菌的试剂盒，所述试剂盒含有前述组合物。

32、进一步，所述耐药念珠菌包括光滑念珠菌和/或耳念珠菌。

33、本发明的有益效果在于：

34、1.与既往报道的研究不同，本发明不以dna的含量作为检测方法的评价，而是直接计数孢子进行检测，标准曲线也是以孢子量作为横坐标，根据检测所得到的ct值能够大致计算出每个反应含有多少孢子量，更符合临床感染的实际情况，除了检测出耐药菌的存在还能够估算菌载量，以期更快速、准确地进行治疗。

35、2.本发明所建立的检测方法，标准曲线在10-106个孢子/反应之间有良好的线性范围，检测的下限一般在10个孢子/反应，在重复验证的过程中某些引物和探针的检测下限有时甚至达到1个孢子/反应，灵敏度极高。

36、3.本发明建立的位点特异封闭实时定量pcr利用特异性封闭寡核苷酸肽封闭大量野生型模板的扩增，使敏感菌株的比例低至1％时仍可以被检测到，理论上可以用于临床样本中混合感染的检测，在样本中菌量很小时也能检测出，不需要依赖于培养阳性。