一种EDARpVa1370Ala突变检测试剂在制备胸腺发育评价试剂盒中的应用方法

本发明属于应用方法，具体地说，涉及一种edar pva1370ala突变检测试剂在制备胸腺发育预测评价试剂盒中的应用。

背景技术：

1、我们研究的位点全称为nm_022336.4(edar):c.1109t>c(p.val370ala)。edar是一个编码人类表皮生长因子受体同源蛋白的基因。edar基因位于2号染色体上，总长度为94750bp，包含12个外显子，是可溶性配体eda的受体，可参与调节nf-kb、jnk和半胱氨酸胃蛋白酶信号通路。

2、通过研究发现，edar基因的变异会影响女性乳房的大小，它们会影响人类乳房的发育。

3、edar是外胚层附属物生长发育所必需的蛋白，外胚层附属物生长发育所必需的。edar信号通路在不同类型毛囊的发育、毛发形成和皮脂腺的形态发生中发挥着重要作用,可以控制胚胎和上皮细胞，并调节毛囊细胞的分化过程。

4、这个基因的位点rs3827760有两种类型：突变型和野生型。在欧美和南美人的基因座主要以t基因型为主，为原始的edar基因，也就是edarv370野生型，这会导致女性的乳房较大。而亚洲则是出现了c基因型，是这种基因的突变型，我们称之为edarv370a突变型，会导致女性乳房较小。所以，检测edar基因rs3827760位点是t基因型还是c基因型可以预测胸部未来较大还是较小。

5、为了证明edar基因的作用，科学家们利用转基因小鼠的验证得出结论，edar基因突变的小鼠乳房发育较小。在edar基因突变的影响下降低乳腺脂肪含量。亚洲和欧洲组乳腺的大小与edr基因突变密切相关。当然，370v等基因会使欧洲人和美国人的身体臭味更重，头发发达，头发更细等。还有其他变化，370a基因会让东亚人增加汗腺和皮脂腺，干燥粗糙的头发，并拥有独特的铲形门门齿，edar基因也会导致edar基因变异的亚洲人群拥有粗糙的头发和小乳房。

6、不仅人类进化受到影响，edar基因的研究也有助于了解皮肤和牙齿遗传疾病的发病机制。edar基因突变也已被证明也影响人类头发生长。

7、edar基因的巨大潜力和进一步研究的重要性可以通过在各个领域对edar基因进行广泛研究来认识。edar基因是一个重要的基因，其变异和突变在检测胸腺发育中起着重要作用。

8、有鉴于此特提出本发明。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

2、一种edar pva1370ala突变检测试剂在制备胸腺发育评价试剂盒中的应用方法，包括以下工作步骤：

3、第一步：pcr体系配制；

4、收到样本和测试信息后，首先核对样本的名称与测试信息是否一致，无误后再开始实验，本次实验样本编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，检测位点为edarpva1370ala；

5、第二步：制备微滴；

6、第三步：整理实验数据和制备实验结果图。

7、作为本发明的一种优选实施方式，所述第一步中还包括：

8、将edar_p.val370ala引物与探针结合使用，edar_p.val370ala扩增引物的序列如下：

9、edar_p.val370ala f向引物；tcgagaagactagccgaatgc

10、edar_p.val370ala r向引物；ccctcttcaggccgaagct

11、用于检测的杂交荧光探针序列如下：

12、edar_p.val370ala突变型探针：tctgagaaggctgctg

13、edar_p.val370ala野生型探针：tctgagaaggctgttg

14、按照测试信息取出引物探针并按照要求稀释，方法如下：

15、a、引物探针14000转离心2min，离心后取出根据引物探针管壁上信息加入te；b、加入te后的引物探针涡旋振荡1min，5000转离心30s；

16、c、离心后取出引物探针原液，取2μl原液用无核酶水稀释10倍至1.5ml离心管中，离心管盖上写上对应引物探针名称及稀释日期，涡旋振荡1min，5000转离心30s。

17、作为本发明的一种优选实施方式，所述第一步中还包括：dna用qubit3.0定量，按照测试信息用无核酶水稀释至指定浓度；取出反应预混液(微滴式数字pcr用反应预混液)，室温放置2分钟；准备样本制备通用耗材，可穿刺热封膜。在8连管中配制pcr反应体系，反应终浓度引物/探针900nm/250nm；通过旋涡振荡混匀pcr反应混合液，用离心机快速离心，以确保所有成分都在反应管的底部，让反应管在室温下静置3分钟。

18、作为本发明的一种优选实施方式，所述第二步还具体的包括：

19、a、将微滴生成芯片置于芯片卡座中，向油相孔加入50μl微滴生成油，向样本孔中加入20μl已加入模板的pcr反应混合液，然后在各样本孔水相上方加入密封剂，待油相和水相加入完成后，盖上微滴生成芯片密封垫；

20、b、将微滴生成仪和气泵打开，仪器自检完成后，气压泵数值为0.2mpa；轻按红色按钮打开仓门，将微滴生成芯片放入微滴生成仪，长按红色按钮，开始生成微滴；

21、c、待微滴生成后，依次小心将生成的微滴转移至pcr反应板中；

22、d、打开封膜仪，设置一定的封膜仪温度和封膜时间，待温度达标点击开门按钮，打开仓门将96孔板放入底座，盖上可穿刺热封膜，点击关门，点击封膜；封好膜之后进行pcr扩增；

23、e、打开pcr仪，设置pcr仪程序，将封膜完成的96孔板放入，盖上热盖，扭紧热盖上的旋钮，点击运行；

24、f、pcr结束前打开微滴检测仪，打开分析软件，点击清洗，若两天以上未用需点击灌洗；

25、g、清洗结束后在界面左侧录入信息包括样本名称，目的基因1，目的基因2；

26、h、完成后轻按微滴检测仪的红色按钮，打开仓门，取下底座上的盖板，取出pcr结束的样本放入录入信息对应的孔位，压紧盖板，轻按微滴检测仪的红色按钮，关上仓门，点击微滴检测仪的分析软件界面上的运行，等待结果分析完成。

27、作为本发明的一种优选实施方式，所述c中，微滴为45-55μl。

28、作为本发明的一种优选实施方式，所述a中，在各样本孔水相上方加入5μl密封剂。

29、作为本发明的一种优选实施方式，所述f中，pcr结束前10min打开微滴检测仪。

30、作为本发明的一种优选实施方式，所述d中，封好膜之后应于30分钟内进行pcr扩增。

31、作为本发明的一种优选实施方式，所述d中，设置封膜仪温度为190℃，封膜时间为5s。

32、本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

33、本发明通过第一步的数字pcr体系配制、第二步的制备微滴和第三步的整理实验数据和制备实验结果图，实现了edar pva1370ala突变检测试剂在制备胸腺发育评价试剂盒中的应用，本发明的应用方法科学且高效，能够有效的检测出edar pva1370ala基因的变异情况；此外，本发明所提供的edar突变检测试剂在制备胸腺发育评价试剂盒中的应用方法，不仅能够验证edar基因对人类与小鼠等动物乳腺发育的影响，还能根据此应用方法来了解毛发、牙齿未来的成长情况，因此本发明所提供的应用方法在对edar基因研究的各个领域上，都拥有较大的重要作用和价值。

34、下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。