利用CBE构建三基因缺失PRV毒株的方法和应用

本发明涉及生物，具体涉及利用cbe构建三基因缺失prv毒株的方法和应用。

背景技术：

1、伪狂犬病（pseudorabies，pr）是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus，prv）感染相关宿主引起的一种烈性传染性疾病。prv无特定的宿主嗜性，可感染包括猪、牛、羊、狗在内的多种哺乳动物。猪是其自然宿主和主要传染源，prv可引起仔猪严重的神经症状。prv基因组全长约为143kb，gc含量高达70%，可划分为重复区域、独特长区段（unique long，ul）、独特短区段（unique short，us）。ul区包含胸苷激酶（thymidine kinase，tk）、gb（glycoprotein b）、gc、gh等基因；us区则主要有蛋白激酶（protein kinase，pk）、gd、ge、gi等基因。tk、ge和gi三个基因的缺失可降低prv的毒性。

2、早期的基因编辑技术常利用dna同源重组原理，包括zfns和talens，但因其设计复杂、敲除效率低、脱靶严重、成本高、可操作性差等缺点，发展受到了限制。crispr/cas9系统自发现以来由于其高效、方便和应用范围广等特点，成为最受欢迎的基因改造工具，实现了基因的成功敲除。然而与zfns和talens等技术类似，crispr/cas9实现基因编辑依赖于dna双链断裂的产生，触发修复，造成非预期的碱基突变或脱靶切割及基因组的结构变异。为了克服这一不足，单碱基编辑技术的出现为实现精确高效的碱基转换带来了希望。

3、单碱基编辑技术是利用无核酸酶切割活性或切割单链产生缺口活性的改造型cas蛋白和脱氨酶进行融合，依靠sgrna准确地将脱氨酶锚定到靶位点，进行碱基脱氨，从而实现单碱基的精确编辑，极大提高了碱基编辑的精确度和效率。2016年，刘如谦教授团队研发出了碱基编辑器（base editor, be），可直接、不可逆转地将dna链上的碱基c替换为t（或者将g替换为a），无需切割dna双链或提供同源dna模板。研究人员将无切割dna双链活性的dcas9通过linker序列与大鼠胞嘧啶核苷脱氨酶(rapobec1)相融合，构建出第一代碱基编辑器be1；后引入了尿嘧啶dna糖基酶抑制剂（uracil dna glycosylase inhibitor，ugi），构建出第二代碱基编辑器be2；为利用细胞中的错配修复机制促进非编辑链以编辑链为模板进行修复，进一步增强点突变效率，研究人员恢复了dcas9的dna单链切割活性（cas9nd10a），构建出第三代碱基编辑器be3。be3是目前运用较为广泛的经典胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor, cbe)。随着cbe编辑系统的不断优化和发展，研究人员又先后开发出be4、sabe4、be4-gam、sabe4-gam、be4max和anc be4max，进一步提高了碱基编辑的效率。cbe系统凭借其高效精确的基因编辑效果，为相关疾病的基因治疗、动物疾病建模、微生物研究等提供了强有力的技术手段。目前cbe在prv基因组改造中已经开始尝试，但只是涉及单个基因单一位点的简单突变，未进行一步法进行多个基因的多个位点同时编辑类似复杂突变，本发明通过优化cbe载体选择和sgrna设计，一步实现了tk、ge和gi三个基因的六个位点均突变成功，蚀斑纯化后成功获得了三基因缺失的prv-δtk/δgi/δge-cbe毒株。

4、现有的zfns、talens耗时耗力使用昂贵，crispr/cas9效率低，筛选困难，同时因为基因组的断裂造成结构变异的产生，新型的碱基编辑工具cbe通过引入终止密码子诱导基因表达的提前终止，可以实现沉默的目的，但产生的旁观者效应较多，同时受pam限制，有些区域无法编辑。

技术实现思路

1、本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供利用胞嘧啶碱基编辑器快速构建ge、gi、tk基因缺失prv毒株的方法和应用。

2、本发明的技术问题解决方案如下：

3、ge、gi、tk基因缺失的prv毒株，于2023年6月30日保藏在中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号cctcc no：v202375，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，命名为：猪伪狂犬病毒prv-δtk/δgi/δge-cbe，porcine pseudorabies virus prv-δtk/δgi/δge-cbe；所述ge、gi、tk基因缺失的prv毒株利用胞嘧啶碱基编辑器构建得到。

4、ge、gi、tk基因缺失的prv毒株，其编码ge基因序列如seq id no.14所示，其编码gi基因序列如seq id no.15所示，其编码tk基因序列如seq id no.13所示；

5、利用胞嘧啶碱基编辑器快速构建ge、gi、tk基因缺失prv毒株的方法，包括以下步骤：

6、s1：构建sgrna骨架质粒；

7、选择prv病毒中ge、tk、gi三基因作为靶标位点，利用胞嘧啶碱基编辑器设计sgrna序列，根据sgrna上下游序列分别合成单链寡核苷酸，将单链寡核苷酸退火获得带粘性末端的双链dna片段，将pu6-sgrna-puro-2a-egfp载体经限制性内切酶酶切后回收片段，再与上述带粘性末端的双链dna 片段连接，获得连接产物，即sgrna表达载体；

8、所述胞嘧啶碱基编辑器为pcmv-ha3a-be3-y130f；

9、将连接产物转化至感受态细胞中，涂板筛选培养，挑阳性菌扩大培养，对阳性菌液抽提质粒；

10、s2：质粒转染；

11、将质粒转染至vero81细胞中，对通过转染获得的病毒进行蚀斑纯化，每一轮均通过pcr扩增与测序的方法进行验证；纯化得到的tk、gi、ge三基因缺失病毒。

12、作为本发明的优选方案，所述限制性内切酶为bbsⅰ酶。

13、作为本发明的优选方案，所述pcmv-ha3a-be3-y130f包括表达ncas9蛋白的质粒。

14、作为本发明的优选方案，所述单链寡核苷酸分别如seq id no.1，seq id no.2，seq id no.3，seq id no.4，seq id no.5，seq id no.6，seq id no.7，seq id no.8，seqid no.9，seq id no.10 ，seq id no.11，seq id no.12所示。

15、作为本发明的优选方案，所述转染前，将vero81细胞在含有胎牛血清的培养液中进行培养，培养至对数生长期。

16、一种ge、gi、tk基因缺失的prv毒株，采用如上任一所述的方法制得。

17、本发明公开了一种如上所述的ge、gi、tk基因缺失的prv毒株在制备伪狂犬疫苗上的应用。

18、本发明的有益效果是：本发明的方法效率高，对病毒基因的改变小，不引起病毒基因组出现大的结构变异，成本低。同时prv病毒gc含量较高，普通cbe编辑效果不佳，本发明利用适用于高gc背景的新型cbe进行prv改造，提高编辑的成功率。再者，本发明提供一种新型一步制备prv毒力基因tk，gi和ge沉默的方法，获得tk，gi和ge沉默的prv野毒株。本发明提供的方法，对prv基因组的tk，gi和ge基因进行编辑，每个基因提前引入两个终止密码子，成功拯救tk，gi和ge沉默毒。所述tk，gi和ge基因沉默毒与prv野毒区别在于将终止密码子引入tk，gi和ge毒力基因的序列5’编码区域，从而达到提前终止基因正常转录表达。本发明还对高gc背景的病毒序列编辑进行改进，选用适合gc位点编辑的cbe，提高了编辑的成功率。

19、本发明运用该技术制备的tk，gi和ge基因缺失的prv毒株不存在结构变异，只是引入tag、taa和tga终止密码子，就能够实现tk，gi和ge表达的终止，而且该序列潜在的调控作用受到的影响最小，即本发明通过提前引入终止密码子，实现基因终止表达，无需大片段缺失，仅是改变几个碱基类型，做到对病毒原有调控序列影响最小，同时可以一次实现多个基因的同时缺失，无需分步进行，操作非常简单快捷。

20、本发明的ge、gi、tk基因缺失的prv毒株，于2023年6月30日保藏在中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号cctcc no：v202375，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，命名为：猪伪狂犬病毒prv-δtk/δgi/δge-cbe，porcine pseudorabies virus prv-δtk/δgi/δge-cbe。