利用CBE构建三基因缺失PRV毒株的方法和应用

文档序号:36240800发布日期:2023-12-02 01:10阅读:来源:国知局

技术特征:

1. ge、gi、tk基因缺失的prv毒株,其特征在于,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号cctcc no:v202375,所述ge、gi、tk基因缺失的prv毒株利用胞嘧啶碱基编辑器构建得到。

2.根据权利要求1所述的ge、gi、tk基因缺失的prv毒株,其特征在于,其编码ge基因序列如seq id no.14所示,其编码gi基因序列如seq id no.15所示,其编码tk基因序列如seqid no.13所示。

3.利用cbe构建ge、gi、tk基因缺失prv毒株的方法,其特征在于,包括以下步骤:

4.根据权利要求3所述的利用cbe构建ge、gi、tk基因缺失prv毒株的方法,其特征在于,所述限制性内切酶为bbsⅰ酶。

5.根据权利要求3所述的利用cbe构建ge、gi、tk基因缺失prv毒株的方法,其特征在于,所述pcmv-ha3a-be3-y130f包括表达ncas9蛋白的质粒。

6. 根据权利要求3所述的利用cbe构建ge、gi、tk基因缺失prv毒株的方法,其特征在于,所述单链寡核苷酸分别如seq id no.1,seq id no.2,seq id no.3,seq id no.4,seqid no.5,seq id no.6,seq id no.7,seq id no.8,seq id no.9,seq id no.10,seq idno.11,seq id no.12所示。

7.根据权利要求3所述的利用cbe构建ge、gi、tk基因缺失prv毒株的方法,其特征在于,所述转染前,将vero81细胞在含有胎牛血清的培养液中进行培养,培养至对数生长期。

8.一种如权利要求1或2所述的ge、gi、tk基因缺失的prv毒株在制备伪狂犬疫苗上的应用。


技术总结
本发明公开了利用CBE构建三基因缺失PRV毒株的方法和应用,涉及生物技术领域,选择PRV病毒中gE、TK、gI三基因作为靶标位点,设计sgRNA序列,根据sgRNA上下游序列分别合成单链寡核苷酸,然后退火获得带粘性末端的双链DNA片段,将载体经限制性内切酶酶切后回收片段,再与带粘性末端的双链DNA片段连接,获得连接产物;将连接产物转化至感受态细胞中,涂板筛选培养,挑阳性菌扩大培养,对阳性菌液抽提质粒;将质粒转染,对通过转染获得的病毒进行蚀斑纯化,每一轮均通过PCR扩增与测序的方法进行验证;纯化得到单克隆毒株;本发明方法效率高,对病毒基因的改变小,不引起病毒基因组出现大的结构变异,成本低。

技术研发人员:叶昱,顾俊,曾川,沈金燕,王培霞,唐玉新,王妮,白雨溦,黄冬艳,宋德平
受保护的技术使用者:江西农业大学
技术研发日:
技术公布日:2024/1/16
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