DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用与流程

本发明属于真菌菌种鉴别领域，具体涉及一种用于鉴别普洱茶发酵生产用菌株的dna条形码引物组合物、dna条形码、试剂盒、方法及应用。具体而言，所述普洱茶发酵生产用菌株为布朗克假丝酵母(candida blankii)tmcc 70011菌株。

背景技术：

1、普洱茶是一种具有云南地理标识范围内生产的后发酵茶，其采用大叶种晒青毛茶作为原料，经过一系列工艺制作而成。传统的普洱茶制作过程为：采摘的新鲜茶叶经揉捻、晒青后制成原料晒青毛茶，之后经除杂、潮水、渥堆、晾干、筛分、压制成型、包装出厂。在普洱茶的生产中，渥堆发酵过程是普洱茶品质形成的主要因素，在此过程中，茶叶中诸如茶多酚、咖啡因以及一些多糖物质等内含成分发生了巨大变化，成就了普洱茶的特殊风味、口感、品质以及各种保健功效。

2、在传统的普洱茶生产中，湿热的环境激活茶叶本身所含的酶，使得茶叶中所含的一部分内含成分转化成微生物能利用的物质；普洱茶发酵过程中微生物也大量生长，产生丰富的胞内酶和胞外酶，催化茶叶中内含成分发生一系列转变，由此形成普洱茶独特的品质。不同的产地，微生物种类及其群落结构的差异，使得普洱茶风味及品质也各具特色。

3、普洱茶除了其独特的风味和文化外，其诸如减肥、降血糖和血脂、预防和改善心血管疾病、抗衰老、抗癌、消炎、助消化以及养胃等保健功效也备受人们关注，并越来越受消费者欢迎。逐渐增加的市场需求拉动了普洱茶产业的发展，促进了云南地区经济增长。

4、随着人们生活水平的提高，消费者对食品的卫生、安全等问题日益重视。然而，近几年食品质量安全事件频发，茶叶质量及其安全问题也越来越受到关注。除了农药的残留问题之外，普洱茶渥堆发酵过程中微生物也有可能成为影响茶叶质量的重要因素，因此普洱茶产业发展也面临着一些困境。例如，产品质量不稳定，生产周期长，劳动力投入过高，微生物数量超标和螨虫滋生等。

5、目前多数生产商的普洱茶生产仍然是半自然人工渥堆的经验式发酵，虽然渥堆过程中以包括布朗克假丝酵母(candida blankii)在内的优势共性微生物为主的群落相对稳定，但产品的稳定性还存在较大的提升空间，生产过程中也不可避免地存在着一定的安全隐患。要进一步获得消费者的青睐和市场的认可、突破外贸壁垒，提升普洱茶企业的市场竞争力，必须实现普洱茶生产的人工可控、清洁化以及高效化，并不断开发新产品、延伸产业链。要做到这些，就必须革新技术，发明一系列安全、清洁、高效、人工可控的自动化普洱茶新工艺，才能确保普洱茶产业的健康发展。

6、人工接种和普洱茶的纯种发酵是普洱茶可控发酵的新发展方向。为保护普洱茶发酵工艺和优质微生物种质资源，开发对普洱茶发酵用菌种快速、精准鉴别方法势在必行。

7、dna条形码技术可快速、简便地鉴别、区分与其相似菌种，可为普洱茶人工可控纯种发酵工艺开发和资源保护提供理论依据和技术手段，促进普洱茶产业健康发展。

技术实现思路

1、为克服形态学在鉴定普洱茶发酵生产菌上存在的缺陷，本发明提供了用于鉴别普洱茶发酵用菌种布朗克假丝酵母(candida blankii)tmcc 70011的dna条形码、引物、试剂盒、方法和应用，从而可以准确地将布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株从易混淆的物种或复合种中鉴别出来，也可以准确地鉴别由该菌株发酵生产的普洱茶，实现进行快速鉴别和区分，可为普洱茶新发酵工艺提供快速鉴别、评估，防止发酵过程中其他杂菌的干扰，以及为普洱茶人工可控发酵工艺及菌种滥用提供举证方法和依据。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、(1)一种用于鉴别布朗克假丝酵母菌株或由其发酵生产的普洱茶的dna条形码，其特征在于，该dna条形码来源于布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株的基因组，并且选自如seqid no.4所示的dna序列中的至少1000bp的序列。

4、(2)根据(1)所述的dna条形码，其中所述dna条形码的核苷酸序列包含如seq idno.1或seq id no.2所示的序列；或者，所述dna条形码选自如seq id no.1或seq id no.2所示的dna序列中的序列；优选地，所述dna条形码的核苷酸序列如seq id no.1、seq idno.2或seq id no.4所示。

5、(3)一种用于扩增(1)或(2)所述的dna条形码的引物对。

6、(4)根据(3)所述的引物对，其正向引物的核苷酸序列与布朗克假丝酵母tmcc70011菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述tmcc 70011菌株基因组中如seqid no.4所示的核苷酸序列的第1位到如seq id no.4所示的核苷酸序列的第401位的区域中的序列，并且该正向引物的长度为15-30bp；其反向引物与所述tmcc 70011菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述tmcc 70011菌株基因组中如seq id no.4所示的核苷酸序列的第986位到如seq id no.4所示的核苷酸序列的最后一位的区域中的序列，并且该反向引物的长度为15-30bp。

7、(5)根据(4)所述的引物对，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：

8、正向引物：5’-atgcacccgtgagtatgtga-3’；

9、反向引物：5’-ctcggcagtgttatgctcaa-3’。

10、(6)一种用于鉴别布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株或由其发酵生产的普洱茶的试剂盒，包含根据(3)-(5)中任一项所述的引物对。

11、(7)一种鉴别布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株的方法，包括以下步骤：

12、a)提供待测菌株的基因组dna；

13、b)以步骤a)所述的基因组dna为模板，利用根据(3)-(5)中任一项所述的引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；

14、c)电泳检测pcr产物，如果没有目标条带，则判定待测菌株不是布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株；如果有目标条带，则进行步骤d)和/或e)；

15、d)对所得pcr产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与(1)或(2)所述的dna条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性大于99％，则判定待测菌株为布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株；

16、e)对所得pcr产物进行核酸质谱分析，若该pcr产物的碱基质量与(1)或(2)所述的dna条形码的碱基质量存在差异，并且存在质量差异的碱基数目大于或等于10个，则判定待测菌株不是布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株。

17、(8)一种鉴别由布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株发酵生产的普洱茶的方法，包括以下步骤：

18、a)提供普洱茶样品；

19、b)从所述普洱茶样品中提取微生物菌株的基因组dna；

20、c)以步骤b)所述的基因组dna为模板，利用根据(3)-(5)中任一项所述的引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；

21、d)电泳检测pcr产物，如果没有目标条带，则判定所述普洱茶不是由布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株发酵生产的普洱茶；如果有目标条带，则进行步骤e)和/或f)；

22、e)对所得pcr产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与(1)或(2)所述的dna条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性大于99％，则判定所述普洱茶为由布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株发酵产生的普洱茶；

23、f)对所得pcr产物进行核酸质谱分析，若该pcr产物的碱基质量与(1)或(2)所述的dna条形码的碱基质量存在差异，并且存在质量差异的碱基数目大于或等于10个，则判定所述普洱茶不是由布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株发酵产生的普洱茶。

24、(9)根据(1)或(2)所述的dna条形码在鉴别布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株或由其发酵生产的普洱茶中的应用。

25、(10)根据(3)-(5)中任一项所述的引物对在鉴别布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株或由其发酵生产的普洱茶中的应用。

26、(11)根据(6)所述的试剂盒在鉴别布朗克假丝酵母tmcc

27、70011菌株或由其发酵生产的普洱茶中的应用。

28、本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

29、1、本发明采用蛋白质基因组学技术从布朗克假丝酵母(candida blankii)tmcc70011菌株的基因组中发现了漏注释的肽段。基于该肽段编码序列在基因组中的位置，确定了编码该肽段可能的基因序列和蛋白序列。本发明进一步通过仔细的研究和比较分析，基于该肽段的编码基因(dybxs-1基因)开发了dna条形码，该条形码序列能实现布朗克假丝酵母种内菌株的快速鉴别与区分，可以准确地将布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株从易混淆的物种或复合种中鉴别出来，进而还可以准确地鉴别由该菌株发酵生产的普洱茶。

30、2、本发明进一步发现，相比于其他基因，dybxs-1基因的序列(例如seq id no.1)具有通用、易扩增、易比对的特点，其在布朗克假丝酵母种内不同菌株之间差异明显。

31、3、本发明建立了普洱茶工业发酵生产用菌株布朗克假丝酵母tmcc 70011菌株的标准基因序列和样品鉴别方法。相比于传统的形态学鉴定方法，本发明的方法显著提高了目的菌种的鉴定效率。该方法对于样品的完整程度要求低，鉴别指标能够量化，这对于及时判定普洱茶发酵工艺及其种质资源提供了有效的依据。此外，本发明还可以进一步利用聚类分析的系统发育树法以及基于核酸质谱策略的菌株差异位点阵列，其鉴定的灵敏度和准确性也大大优于常规的分子鉴定方法，弥补了基于dna条形码技术对普洱发酵茶生产用布朗克假丝酵母菌株进行鉴定的空白。