一种乳腺癌类器官专用培养基及培养方法与流程

本发明涉及细胞培养，具体涉及一种乳腺癌类器官专用培养基及培养方法。

背景技术：

1、类器官（organoid），是将具有多能性的细胞进行3天培养，在体外生成的微缩版器官。类器官具备与原始组织类似的显微解剖结构，能自我更新和自我组织，能重现对应器官的部分功能，提供一个高度生理相关系统。而且类器官培养需要的组织极少，培养周期短，成功率高，可避免动物模型建模周期长，培养时间长，成本高等问题。类器官技术在疾病研究、药物筛选、药物毒性毒理反应、基因和细胞治疗等生物医学转化研究领域具有巨大应用潜力，2019年《新英格兰医学》杂志将类器官评价为“preclinical models of humandisease”—人类疾病临床前模型。

2、类器官的来源可来自原始组织的干细胞，胚胎干细胞（esc），诱导性多能干细胞（ipsc）和已建立的细胞系和包含多种细胞类型的器官外植体。但由于伦理问题和获取难度，现在研究和临床所用到细胞来源的主要是原始组织或由体细胞重编程获得的ipsc。自2009年荷兰科学家hans clevers教授团队首次成功培养建立了肠类器官，类器官经历了极大的发展。目前，类器官培养已可应用于包括食道、肠道、胃、肝脏、胰腺、肺、乳腺、肾脏、前列腺、膀胱、大脑、甲状腺、内耳、视网膜、心脏以及卵巢等多种正常或肿瘤组织的类器官研究模型。

3、乳腺癌（breast cancer，bc）是发生在女性乳腺导管上皮或腺小叶的恶性肿瘤，是全世界妇女中最常见的癌症和癌症死亡原因，国家癌症中心于2019年1月发布的最新的全国癌症统计数据显示，乳腺癌仍是女性发病第1位的恶性肿瘤，每年发病人数约为 30.4万。近些年来，乳腺癌的发病率持续上升，对女性的日常生活质量与生命安全造成严重威胁。目前，乳腺癌的治疗和预后方案主要取决于乳腺癌的分期。术前需准确评估肿瘤的特征、侵犯范围和浸润程度。临床分期提供的关键信息决定了手术方式，是否需要手术前后的辅助化疗或激素治疗、放射治疗、前哨淋巴结活检和腋窝淋巴结清扫等。按照乳腺癌的分期、分型，考虑个体的高危复发因素，设计最有效的治疗方案，可以达到一定的治疗效果，但因其残留病灶极易导致局部乳腺癌复发，故患者总体生存率不高。而最近类器官培养的发展为建立和分析病人样本提供了新的机会，允许恶性细胞在类似于乳腺肿瘤三维生长的条件下繁殖，它们已被证明在保持原代样本的异质性方面是有效的，并正在成为进一步表征乳腺癌分子特征的新模型。

4、当乳腺癌类器官培养过程中，培养基的选择是重要的因素。传统培养基由于缺乏类器官生长分化所需的必要因素，类器官在其中无法稳定培养。类器官培养基相对于传统细胞培养基更为复杂和特定，旨在提供更接近类器官的生理环境，以更好地维持和研究类器官的结构和功能。不同的类器官培养基需要根据具体的类器官类型改进合适的配方，以获得最佳的实验结果。

5、申请公开号为cn114634909a的专利公开了一种乳腺癌类器官培养的培养基及培养方法，培养基中含有重组人r-spondin 3蛋白、重组人heregulinβ-1蛋白、fgf-7、重组人kgf/fgf-7因子、重组人fgf-10因子、重组人egf因子、重组人noggin蛋白、a 83-01、y-27632、sb202190、b27、n-乙酰基-l-半胱氨酸、烟酰胺、hepes缓冲液、青霉素、链霉素、谷氨酰胺补充剂和advanced dmem/f12。虽然该培养基与培养方法可缩短类器官的培养周期，但不能做到长期稳定培养。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种乳腺癌类器官专用培养基，该培养基通过改进细胞生长因子、小分子化合物以及培养因子等必要要素以模拟接近体内的生长环境，从而提高了类器官的培养成功率。

2、为达到上述目的，本发明提供一种乳腺癌类器官专用培养基，包括：减血清 dmem、10 mm hepes、2 mm glutamax、1×n-21、1×b-27、1%抗生素、细胞生长因子、小分子化合物、0.1 mg/ml iv型胶原蛋白、0.01 mg/ml oct4蛋白和0.02 mg/ml foxm1蛋白。

3、优选地，所述抗生素为青霉素-链霉素-两性霉素b混合溶液；所述青霉素-链霉素-两性霉素b混合溶液中青霉素的浓度为10000 μg/ml，链霉素的浓度为10000 μg/ml，两性霉素b的浓度为25 μg/ml。

4、优选地，所述细胞生长因子为5 ng/ml egf、100 μg/ml noggin、100 μg/ml r-spondin 1、100 μg/ml r-spondin 3、10 nm neuregulin 1、20 ng/ml fgf-10、5 ng/mlfgf-7的混合物。

5、优选地，所述小分子化合物为5 μm y-27632、10 mm nicotinamide、1.25 mm n-acetylcysteine、500 nm a83-01、1 μm sb202190的混合物。

6、本发明还提供一种乳腺癌类器官培养方法，包括：

7、将新鲜乳腺癌组织样本放入预冷的组织保存液进行预处理；

8、在预处理后的新鲜乳腺癌组织中加入组织酶解液消化癌组织，37℃振荡消化10～20 min，加入三倍体积组织清洗液；

9、使用100 μm孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后于300 g离心3～5 min后移去上清；

10、在离心收集到的组织中添加25倍组织体积的基质胶，进行重悬之后进行铺板，拍照追踪定位；

11、将铺好的板子放入37℃培养箱中10～15 min成胶，添加乳腺癌类器官专用培养基，并使培养基没过细胞，于37℃培养箱中继续培养，每2～3天更换1次类器官培养基，细胞在基质胶上生长，培养至30天，得到类器官-基质胶混合物；

12、使用细胞刮刀将类器官-基质胶混合物取下进行类器官传代，得到类器官细胞，并按500个/ml密度加入冻存液冻存，得到冻存的类器官细胞；

13、从液氮罐中取出冻存的类器官细胞进行类器官复苏。

14、优选地，所述预处理的具体方法为：将新鲜乳腺癌组织样本放入预冷的组织保存液，剔除脂肪组织和坏死的肿瘤组织，只选取活的肿瘤组织，将组织样本转移至离心管中，用4℃预冷的pbs溶液漂洗组织样本，直至漂洗液呈清液状态，将漂洗后的组织转移到培养皿中并剪碎至1 mm3的组织块。

15、优选地，所述类器官传代的具体方法为：

16、将类器官-基质胶混合物转移到15 ml锥形管中，静置3 min，300 g离心5 min后移去上清；加入10倍体积的类器官消化液，用移液枪吹打混合均匀，再放入37℃水浴12 min；加入类器官清洗液，使用100 μm孔径的筛网过滤，300 g离心3～5 min后移去上清；使用基质胶重悬，再次铺板。

17、优选地，所述类器官复苏的具体方法为：从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于37℃水浴锅中融解，融解过程中摇动冷冻管；将融解后的类器官细胞转移至15 ml锥形管，使用移液管吹打3次，300 g离心3 min，除去上清液并收集类器官细胞沉淀；在类器官细胞沉淀中添加类器官清洗液重悬移入离心管，300 g离心5 min除去上清液，收集组织沉淀；

18、在离心收集到的组织沉淀中加入基质胶重悬，得到组织-基质胶混合液，每孔20 μl组织-基质胶混合液铺在24孔板中，放在37℃培养箱中10 min，添加1.5 ml乳腺癌类器官专用培养基，培养至30天。

19、本发明所达到的有益效果：

20、iv型胶原蛋白是细胞基底膜的主要成分，本发明在培养基中添加iv型胶原蛋白，可以协助基质胶模拟体内细胞外基质的支撑作用，更好地模拟乳腺癌细胞在体内的生理环境，有助于类器官细胞的附着和生长。

21、iv型胶原蛋白中的arg-gly-asp（rgd）短肽基序、cb3片段等，能与细胞外的整合素和非整合素受体结合，并参与细胞信号转导。本发明在培养基中添加iv型胶原蛋白，它能与癌细胞的整合素结合，进而激活癌细胞内信号转导通路，促进癌细胞的增殖、生长及迁移，有利于促进乳腺癌类器官的生长并逐渐形成特定的结构和组织。

22、oct4是一种pou家族的转录因子，它的主要功能是能够与含有八聚体基序（atgcaaat）的天na结合，转录激活其下游靶基因的表达，在胚胎发育过程和维持干细胞多潜能性中起关键作用，可促进肿瘤干细胞的更新和分化。foxm1可以与血管内皮生长因子的启动子进行结合，在转录水平上对血管内皮生长因子的表达进行调控，可有效地促进肿瘤血管的生成过程，进而地促进肿瘤组织的发生与生长。本发明在培养基中添加了oct4蛋白和foxm1蛋白，协同提高了癌细胞增殖生长的相关基因的转录水平，从而也促进了乳腺癌类器官的生长。

23、本发明提供的乳腺癌类器官专用培养基包含一些特定的培养因子，同时也具备培养类器官所需的细胞因子和小分子化合物，能极大的模拟乳腺癌细胞在人体的微环境，促进类器官的生长与分化。

24、本发明提供的乳腺癌类器官专用培养基有效降低类器官培养的复杂程度，将原先几十种试剂和几十种配置过程，简化为方便随时取用的培养基成品，极大的简化了操作流程，同时，减少了原有配置过程可能发生的污染与损耗。