一种利用呼吸作用相关基因表达量评估不同酵母高代数应用能力的方法与流程

本发明属于啤酒酵母性能评估，尤其涉及到一种利用呼吸作用相关基因表达量评估不同酵母高代数应用能力的方法。

背景技术：

1、啤酒分为上面发酵啤酒和下面发酵啤酒。上面发酵啤酒称“ale”，由会在酿造的过程中上浮至表面的酵母酿酒酵母s.cerevisiae发酵而成，下面发酵啤酒则是在德国等较为寒冷的地区发展起来的，而在温度较高的季节则将啤酒储存在放了冰块的山洞中，这一过程称为“lager”。用这种方式酿造啤酒，酵母不会上浮而是沉到底部，因此这些酵母称为“下面发酵酵母”。现代社会中，大部分的工业酿造啤酒均为lager酵母发酵而来。现代啤酒生产的关键工艺之一为酵母的回收重复接种，每一次回收后称为一代。酵母的应用代数提高，会节约成本，有利于生产的有序进行。

2、lager酵母s.pastorianus是ale啤酒中s.cerevisiae与2011年新发现的s.eubayanus杂交后驯化的产物，是一种具有高度染色体倍性、染色体结构组成复杂的异源多倍体菌种。作为异源多倍体，其基因组包含了两种酵母(酿酒酵母s.cerevisiae与真贝氏酵母s.eubayanus)的亚基因组。基因组的遗传稳定性是维持细胞正常增殖和分化的关键，也是维持生物有机体正常生理活动的基础。dna复制和细胞编程错误、基因表达调控异常、dna损伤修复失败都会影响基因组的稳定性。这种基因组的不稳定性通常会引起遗传物质发生改变(如：核苷酸突变、染色体畸变等)，进而引发酵母生长能力和发酵能力的衰退。在高传代应用过程中经常会发生性能衰退，出现絮凝、降糖等方面的问题，这很大程度上是由于lager酵母的基因组不稳定性。

3、dna损伤是基因组不稳定主要原因。在发酵环境中，酵母面对发酵环境中的各种胁迫产生的活性氧自由基成为基因组稳定性主要因素。活性氧自由基可以进攻碱基上的双键，导致开环反应等，还可以破坏磷酸核糖骨架，造成dna损伤，导致基因组稳定性下降。

4、受到胁迫的条件下，活性氧自由基会在酵母的生理过程中产生。活性氧自由基的主要产生来源：线粒体呼吸链中的氧化磷酸化过程、内质网中蛋白折叠以及细胞骨架的稳定化。其中最主要的产生来源为线粒体中的呼吸作用(氧化磷酸化)相关过程。因此，测定在发酵和传代中的酵母呼吸作用相关基因表达量及其上游调控基因的表达量，可以反映酵母该代数应用的潜力。然而，对于酵母高代数应用能力的评价，现在的研究不多。现有的方法集中在对于酵母高代数传代应用后出现问题的解释，而非评价酵母高代数应用的能力。

技术实现思路

1、本发明提供了一种利用呼吸作用相关基因表达量评估不同酵母高代数应用能力的方法，该方法可实现在选育阶段提前评估酵母高代数应用能力，提升选育效率，节约时间和成本，有效解决了从基因表达层面评估酵母高代数基因组稳定性乃至高代数应用的问题。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种利用呼吸作用相关基因表达量评估不同酵母高代数应用能力的方法，通过对选育过程中的啤酒酵母在发酵特定时间点的呼吸作用相关基因表达量及其上游调控基因的表达量进行计算并进行差异显著性分析，以从基因表达层面评估酵母高代数基因组稳定性。

3、作为优选，所述呼吸作用相关基因选自qcr7(gene id:852142)、cyc1

4、(gene id:853507)和cox1(gene id:854598)，所述上游调控基因为rox1

5、(gene id:856178)。

6、作为优选，分别设计呼吸作用相关基因及其上游调控基因的特异性引物，具体为：qcr7-f如seq id no.1所示，qcr7-r如seq id no.2所示，cyc1-f如seq id no.3所示，cyc1-r如seq id no.4所示，cox1-f如seq id no.5所示，cox1-r如seq id no.6所示，rox1-f如seq id no.7所示，rox1-r如seq id no.8所示。

7、在上述方案中，qcr7-f(5’-3’)：caactcggtttgatgagccc；

8、qcr7-r(5’-3’)：agtcacccgtcctctccaa；

9、cyc1-f(5’-3’)：caaggccggttctgctaaga；

10、cyc1-r(5’-3’)：agcttgaccagagtgtctgc；

11、cox1-f(5’-3’)：agtggtatggcaggaacagc；

12、cox1-r(5’-3’)：cactgagaggcgcaccatta；

13、rox1-f(5’-3’)：cacacgacccttcaacgaga；

14、rox1-r(5’-3’)：ccggtgtttgactgctgttg。

15、作为优选，所述特异性引物本身为20bp±3bp，pcr产物长度为100-200bp，tm值为50-65℃，且上下游引物tm值相差不超过1℃。

16、作为优选，通过对选育过程中的啤酒酵母在发酵特定时间点的呼吸作用相关基因表达量及其上游调控基因的表达量进行计算并进行差异显著性分析具体为：

17、将不同的酵母样品分别用冰冷的生理盐水洗涤，rnalater处理后，提取rna；

18、将rna样品用无rnaase的水调整到同一浓度后，进行反转录，获得cdna；

19、以cdna为模板，act1基因作为内参，进行qpcr反应；

20、计算不同选育酵母的ebc管发酵后的呼吸作用相关基因及其上游调控基因表达量，并进行差异显著性分析，当选择基因的表达量水平的p值＜0.05，则判定不同选育酵母菌株的高代数应用能力存在差异。

21、可以理解的是，呼吸作用相关基因表达高，则呼吸作用较强，从而会产生更多的活性氧自由基，活性氧自由基的水平高则会产生更多的dna损伤，造成酵母基因组稳定性的下降，高代数应用能力低。

22、在上述方案中，由于act1在生物体内稳定表达，作为内参基因，是qpcr检测中的常用方法，引物为act1-f：tatgtgtaaagccggttttgc；act1-r：gacaataccgtgttcaattggg。

23、作为优选，发酵时间为4天。可以理解的是，4d正是啤酒发酵中酵母从对数生长期转为平稳期的时间，在此时间点，麦汁中的糖基本耗尽，酵母从厌氧代谢逐步转为呼吸作用。因此，测量这个时间点呼吸作用相关基因表达量能够反映呼吸作用产生的活性氧自由基量，从而反映活性氧自由基的产生量，最终获得酵母基因组稳定性和高代数应用能力。

24、作为优选，qpcr反应体系包括：10μl tb green premix taq 2x、0.4μlforwardprimer 10μm、0.4μl reverse primer 10μm、2μl dna模板(<100ng)、7.2μl灭菌水，共计20μl；

25、qpcr反应条件为两步法pcr扩增程序：阶段1：预变性，重复1次，95℃30s；阶段2：pcr反应，重复40次，95℃5s，60℃34s；阶段3:溶解曲线分析。

26、作为优选，所用酵母样品采用的发酵与传代方法具体为：

27、将酵母从冷冻管中倒入ypd培养基小试管中，25℃活化1.5d，期间手摇匀3次，然后用接种环接入ypd培养基小试管中，25℃活化1.5d，期间手摇匀3次，重复1次；

28、进行ebc管发酵实验，取4d酵母泥回收后重复进行ebc管发酵实验，重复进行2次后，取第3次发酵实验的4d发酵液，离心后取酵母样品。

29、作为优选，ypd培养基包括酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％。

30、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

31、本发明通过对不同选育酵母在发酵特定时间点的呼吸作用相关基因表达量及其上游调控基因的表达量的对比及差异显著性分析，可实现在选育阶段提前评估酵母高代数应用能力，而不是在生产中进行高代数生产实验，提升选育效率，节约时间和成本，有效解决了从基因表达层面评估酵母高代数基因组稳定性乃至高代数应用的问题。