一种微载体及制备方法与应用以及细胞贴壁培养和回收方法与流程

本发明涉及生物材料，具体涉及一种微载体及制备方法与应用以及细胞贴壁培养和回收方法。

背景技术：

1、细胞培养分为两大类：贴壁培养（adherent culture）又称单层培养或平面培养，以及悬浮培养（suspension culture）。通过细胞培养，可以生产治疗疾病的干细胞、免疫细胞和基因修饰细胞等细胞治疗产品，以及病毒载体、疫苗、抗体、多肽药物、外泌体和微囊泡等细胞来源生物制品。

2、人类、哺乳动物和昆虫等物种来源的很多细胞需要贴附在材料的表面才能生长和增殖，这类细胞可称为贴壁细胞或粘附细胞（adherent cells）。组织培养皿、组织培养瓶和细胞工厂（cell factory）等容器能让贴壁细胞贴附在聚苯乙烯等平坦材料的表面、进行分裂增殖。然而这些培养容器只能为贴壁细胞提供十分有限的生长表面，限制扩增培养后的细胞数量。另外、由天然高分子或/和合成高分子制备而来的微载体可为贴壁细胞提供生长表面。用于细胞培养的微载体一般为直径100-300微米的微球或近似球形的微颗粒，它们可以是实心或具有多孔结构。

3、christian weber报道了使用多种微载体培养人间充质干细胞的细胞系后，采用胰蛋白酶（trypsin）、accutase、胶原酶（collagenase）或它们的混合溶液消化和回收细胞。其结果显示从葡聚糖微载体cytodex 1和cytodex 3上回收细胞的效率极低，只有5%-25%的细胞可以从微载体表面被回收。我们也发现利用这些蛋白酶很难把间充质干细胞分离开来，即使延长酶处理时间，细胞回收率低于50%。

4、综上所述，目前市场上的各种微载体虽然能支持贴壁细胞的扩增，但是存在以下一个或多个问题。（1）细胞扩增后从微载体回收细胞的效率低下；（2）微载体的残留物质以及微载体中的动物来源物质增加细胞产品或由细胞产生的生物制品的安全风险；（3）重组蛋白或多肽等高价格原料的大量使用使微载体制造成本高昂。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的缺陷与不足，本发明提供了一种微载体及制备方法与应用以及细胞贴壁培养和回收方法，促进贴壁细胞扩增和高效回收，而且不含动物来源物质、生产成本低。

2、本发明采用的技术解决方案是：本发明提供了一种微载体，所述的微载体为多糖分子通过交联方式得到的交联微颗粒，所述的微载体在细胞培养环境下能维持多糖微载体的结构稳定，所述的微载体能在酶的作用下完全溶解。

3、本发明的较佳实施例中，所述的微载体在酶的作用下完全溶解的时间为2小时内。

4、本发明的较佳实施例中，所述的微载体中多糖分子的交联度为13.1%-44.2%。

5、本发明的另一个较佳实施例中，所述的交联微颗粒为交联微球或近似球形的交联微颗粒。

6、本发明的另一个较佳实施例中，所述的微载体在常规细胞培养环境下能维持多糖微载体的微球或近似球形结构结构稳定三天以上。

7、本发明的另一个较佳实施例中，所述的微载体在25-41℃的细胞培养环境下能维持多糖微载体的微球或近似球形结构结构稳定三天以上。

8、本发明的另一个较佳实施例中，所述微载体的多糖分子的交联程度使得微载体在细胞培养环境下能维持多糖微载体的结构，并能在酶的作用下完全溶解，所述交联程度为组成多糖的单糖残基中，与交联剂之间或单糖残基之间发生交联反应的单糖残基数量占所有单糖残基数量的比例。

9、本发明的另一个较佳实施例中，所述微载体能在酶的作用下完全溶解的时间为30分钟内。

10、本发明的另一个较佳实施例中，所述的微载体中多糖分子的交联程度为13.1%-38.7%。

11、本发明的另一个较佳实施例中，所述细胞培养环境为能够维持细胞的生存

12、率在90%以上。

13、本发明的另一个较佳实施例中，所述微载体在10-39℃和ph6.5-8.0的条件下可被酶完全溶解。

14、本发明的另一个较佳实施例中，所述酶为多糖酶。

15、本发明的另一个较佳实施例中，所述多糖酶包括淀粉酶、纤维素酶、葡聚

16、糖酶、藻酸酶、壳聚糖酶、透明质酸酶、琼脂糖酶、果胶酶中的一种或几种。

17、本发明的另一个较佳实施例中，所述的微载体的表面为光滑或多孔结构。

18、本发明的另一个较佳实施例中，所述的多孔结构的孔径大于1µm小于

19、100µm。

20、本发明的另一个较佳实施例中，所述多孔结构的孔径通过包括但不限于冷

21、冻温度、冷冻速度的条件进行控制。

22、本发明的另一个较佳实施例中，所述的微载体的表面具有修饰。

23、本发明的另一个较佳实施例中，表面经过修饰的微载体中多糖分子的交联程度为13.6-44.3%。

24、本发明的另一个较佳实施例中，微载体的表面修饰为表面通过化学键结合的带正电荷的基团或分子，或者物理吸附的带正电荷的基团或分子，或者通过化学键结合或物理吸附促进细胞贴附的蛋白、多肽或多糖中的一种或几种。

25、本发明的另一个较佳实施例中，所述的表面通过化学键结合的带正电荷的基团或分子包括但不限于伯胺、仲胺、叔胺、季铵盐。

26、本发明的另一个较佳实施例中，所述物理吸附的带正电荷的基团或分子包括但不限于二乙氨乙基葡聚糖、聚-l-鸟氨酸(plo)、聚-d-鸟氨酸(pdo)、聚-dl-鸟氨酸、聚-d-赖氨酸(pdl)、聚-l-赖氨酸(pll)、聚-dl-赖氨酸、聚-l-精氨酸(pla)、聚-d-精氨酸(pda)、聚-dl-精氨酸、聚-l-高精氨酸(plha)、聚-d-高精氨酸(pdha)、聚-dl-高精氨酸、聚-l-组氨酸(plh)、聚-d-组氨酸(pdh)、聚-dl-组氨酸、聚亚甲基-co-胍(pmcg)、聚烯丙基胺(paa)、聚乙烯基胺(pva)、聚乙烯亚胺、烯丙基胺-二烯丙基胺共聚物和烯丙基胺-马来酸共聚物中的阳离子性聚合物。

27、本发明的另一个较佳实施例中，所述促进细胞贴附蛋白或多肽包括但不限于胶原蛋白，明胶，层粘连蛋白，纤连蛋白，玻连蛋白，胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白或玻连蛋白中促进细胞贴附的片段，以及含有精甘天冬氨酸肽的多肽。

28、本发明的另一个较佳实施例中，所述多糖包括以下物质的一种或多种：淀粉、纤维素、葡聚糖、海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸、琼脂糖、聚半乳糖醛酸和果胶，以及淀粉、纤维素、葡聚糖、海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸、琼脂糖、聚半乳糖醛酸和果胶的衍生物。

29、本发明的另一个较佳实施例中，所述交联方式包括以下方法的一种或多种：化学交联法、光交联、脱氢热交联和离子交联法。

30、本发明的另一个较佳实施例中，所述化学交联利用包括但不限于以下的交联剂对多糖分子的链状结构进行交联或固定：1-3-二氯丙醇、n,n′-亚甲基双丙烯酰胺、2,3-二溴-1-丙醇、1,2,7,8-二环氧辛烷、二乙烯基砜、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺、环氧氯丙烷、单宁酸、京尼平。

31、本发明的另一个较佳实施例中，所述光交联使用能引发交联剂与多糖分子之间发生反应的光源。

32、本发明的另一个较佳实施例中，所述光源为紫外线。

33、本发明的另一个较佳实施例中，所述脱氢热交联在接近真空的环境和高温下进行。

34、本发明还提供一种微载体在培养贴壁细胞中的应用。

35、在本发明较佳实施例中，培养的细胞包括但不限于昆虫细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、人类细胞。

36、在本发明另一个较佳实施例中，哺乳动物细胞或人类细胞的培养温度为36-38度，ph为6.8-8.2。

37、在本发明另一个较佳实施例中，其特征在于，所述方法包括：

38、将多糖溶液、不与水互溶的有机溶剂和乳化剂的液体进行处理形成油包水乳液，添加交联剂，使多糖发生交联反应；

39、或者先在多糖溶液中添加交联剂使多糖发生交联反应，再将交联后的多糖溶液、不与水互溶的有机溶剂和乳化剂的液体进行处理形成油包水乳液。

40、在本发明另一个较佳实施例中，形成所述油包水乳液的方法包括但不限于机械搅拌、均质乳化、膜乳化、喷雾法、超声乳化、超声喷雾、微流控方法。

41、在本发明另一个较佳实施例中，所述方法还包括进行清洗以除去有机溶剂和微载体之外的杂质。

42、在本发明另一个较佳实施例中，所述多糖溶液中多糖的浓度为10%-50 % w/w。

43、在本发明另一个较佳实施例中，所述方法还包括，在添加交联剂之后或添加交联剂的同时，还添加带正电荷的物质或促进细胞贴附的物质，通过物理吸附或化学反应使多糖微球表面带有正电荷或细胞贴附分子。

44、在本发明另一个较佳实施例中，所述不与水互溶的有机溶剂为植物油。

45、在本发明另一个较佳实施例中，所述乳化剂包括但不限于卵磷脂、卡拉胶、瓜尔胶、黄原胶、聚山梨醇酯、纤维素、脂肪酸单甘油酯和甘油二酯、蔗糖酯和蔗糖甘油酯、脂肪酸聚甘油酯、聚甘油聚蓖麻油酸酯、硬脂酰乳酸酯、脱水山梨糖醇酯。

46、在本发明另一个较佳实施例中，所述聚甘油聚蓖麻油酸酯在有机溶剂中的体积分数为1-10%。

47、在本发明另一个较佳实施例中，所述交联剂为环氧氯丙烷。

48、在本发明另一个较佳实施例中，所述环氧氯丙烷与多糖中单糖残基的摩尔比为0.23～0.53:1。

49、在本发明另一个较佳实施例中，所述交联反应的时间大于20小时。

50、本发明还提供一种微载体在作为贴壁细胞培养材料上的应用。

51、本发明还提供一种微载体的细胞贴壁培养和细胞回收方法，对混合微载体、培养基和贴壁细胞，进行细胞培养，然后洗净微载体，同时或分步加入多糖酶和分解蛋白或多肽的酶溶解微载体、确认微载体完全溶解，回收得到贴壁细胞。

52、本发明还提供一种溶解微载体的方法，对于表面修饰了促进细胞贴附的蛋白或多肽的微载体，同时或分步使用多糖酶和分解蛋白或多肽的酶溶解微载体。

53、本发明的有益效果是：本发明提供了一种微载体及制备方法与应用以及细胞贴壁培养和回收方法，制备的微载体可完全溶解，相比于现有的微载体，采用本技术的微载体和方法进行细胞贴壁培养细胞回收效率可达到95%以上，并且采用多糖原材料避免了向细胞产品或细胞来源生物制品中引入动物来源的病原体，同时制造成本显著低于重组明胶、重组胶原蛋白等原材料。