一种提高重组人源化胶原蛋白生产水平的发酵工艺的制作方法

本发明涉及一种提高重组人源化胶原蛋白生产水平的发酵工艺，属于生物发酵。

背景技术：

1、胶原蛋白是人体内非常重要的一类功能性蛋白质，广泛分布于人体的结缔组织中，如皮肤、软骨和骨、肌腱、韧带、角膜、器官被膜、硬脑膜等。人体内含量比较高的ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型胶原蛋白，占总胶原蛋白含量的80-90％。因其具有独特的生物结构，已被广泛应用于医药、保健品及化妆品行业中。

2、胶原蛋白经历了提取法和生物合成法两大生产阶段。基于不同的基因编码技术方式，又可进一步将重组胶原蛋白分为重组类胶原蛋白、重组人源化胶原蛋白以及重组人胶原蛋白。根据国家药监局关于发布重组胶原蛋白生物材料命名指导原则，重组人胶原蛋白是指由dna重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长氨基酸序列，且具有三螺旋结构；重组人源化胶原蛋白是指由dna重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合；重组类胶原蛋白是指由dna重组技术制备的经设计、修饰后的特定基因编码的氨基酸序列或其片段，或是这类功能性氨基酸序列片段的组合，其基因编码序列或氨基酸序列与人胶原蛋白的基因编码序列或氨基酸序列同源性低。

3、其中重组人胶原蛋白载体表达产率和生物活性最优，其次为重组人源化胶原蛋白。重组人源化胶原蛋白的氨基酸序列重复单元与人胶原蛋白氨基酸序列特定功能区相同，与人胶原蛋白氨基酸序列相似度为100％的人源化胶原蛋白会被肌肤主动吸收利用。

4、在重组人源化胶原蛋白的生产中，进一步缩短发酵时间，提高蛋白表达量，降低生产成本，有利于重组人源化胶原蛋白的工业化大规模生产。将重组人源化胶原蛋白表达基因嵌入大肠埃希氏菌宿主内，发酵出高纯度重组人源化胶原蛋白，为产业化生产带来实际应用价值。

5、麦芽浸粉，别名麦芽提取物、麦芽浸出粉。麦芽浸粉是以精选大麦芽为原料，不添加任何其他物料，在通过生物技术手段和设备条件下，从麦芽中抽提而成。麦芽浸粉富含多种碳水化合物及蛋白质类、肽类、氨基酸类、嘌呤和嘧啶类、维生素等物质。麦芽浸粉可以用于微生物的培养，但是麦芽浸粉对于重组人源化胶原蛋白生产的影响，目前还鲜有报道。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种提高重组人源化胶原蛋白生产水平的发酵工艺。具体是以麦芽浸粉作为培养基原材料之一，提供细胞生长所需的生长因子，并相比较于酵母浸粉来说，除了提供氮源外，麦芽浸粉中丰富的碳水化合物类物质也给细胞代谢带来优质碳源，并且价格存在优势，以一定比例替换酵母浸粉，可以降低生产成本，提高重组人源化胶原蛋白的产量。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种提高重组人源化胶原蛋白生产水平的发酵工艺，是向含有酵母浸粉的发酵基础培养基中添加麦芽浸粉以替代部分酵母浸粉，构成发酵培养基，接种发酵菌株，发酵生产重组人源化胶原蛋白，所述麦芽浸粉替代酵母浸粉的比例为5-20％，质量百分比。

4、根据本发明优选的，所述麦芽浸粉替代酵母浸粉的比例为10-20％。

5、根据本发明优选的，所述发酵基础培养基的组成为：酵母浸粉2-4％，甘油0.5-3％，七水硫酸镁0.1-0.4％，硫酸铵0.2-0.5％，硫酸钠0.06-0.15％，氯化钠0.2-1.5％，磷酸二氢钾0.2-0.8％，十二水磷酸氢二钠0.5-2.3％，微量元素溶液(过膜除菌)0.2-0.6％，余量水，均为质量百分比；

6、其中，微量元素溶液包括：硼酸0.22-0.35％，钼酸钠0.01-0.02％，七水硫酸亚铁0.14-0.27％，一水硫酸锰0.055-0.12％，二水氯化铜0.015-0.035％，一水硫酸锌0.022-0.033％，四水酒石酸钾钠0.15-0.32％，氯化钴0.05-0.9％，浓硫酸0.05-0.1％，余量水，均为质量百分比。

7、根据本发明优选的，所述发酵菌株为重组表达氨基酸序列如seq id no.1所示的人源化iii型胶原蛋白的大肠埃希氏菌col 1。

8、进一步优选的，所述大肠埃希氏菌col 1是以大肠埃希氏菌bl21(de3)为宿主菌构建得到的。

9、本发明中，重组人源化胶原蛋白的发酵方法，在调整了发酵培养基的组成之后，可按照现有技术进行发酵培养，生产重组人源化胶原蛋白。

10、本发明一种优选的技术方案，一种提高重组人源化胶原蛋白生产水平的发酵工艺，具体包括如下步骤：

11、a.种子液培养：取大肠埃希氏菌col 1接种至种子培养基中，36-38℃、170-200rpm下培养，得到种子液，所得种子液的od600在3以上；

12、b.发酵培养基配制：向发酵基础培养基中加入麦芽浸粉以替代部分酵母浸粉，构成发酵培养基，所述麦芽浸粉替代酵母浸粉的质量百分比为5-20％，灭菌后备用；

13、c.发酵：将步骤a培养好的种子液接种到步骤b灭菌后的发酵培养基中开始发酵，初始发酵条件：通气量1-1.3vvm，搅拌转速130-150rpm，发酵温度36-38℃，使用50％氨水调节ph为6.8-7.5，溶氧为98％-102％；

14、发酵过程中，溶氧不断降低，关联搅拌使溶氧控制在15-30％；

15、当发酵培养基中甘油耗尽时，溶氧会出现明显上升的现象，溶氧上升至55-75％，此时开始补加甘油；

16、当发酵液od600为60-80时，调节发酵温度为25-30℃，并添加过膜除菌后的iptg，使其终浓度为0.3-0.6mm，开始诱导表达重组人源化胶原蛋白；

17、当发酵液od600不再增加时，结束发酵。

18、进一步优选的，步骤a中所述种子培养基的组成为：酵母浸粉0.5％，蛋白胨1.0％，氯化钠1.0％，余量水，均为质量百分比。

19、进一步优选的，步骤a中所述种子液的od600为3-5。

20、进一步优选的，步骤c中所述种子液的接种量为1-3％，质量百分比。

21、进一步优选的，步骤c中补加的甘油浓度为50wt％，补料速度为0.4-0.7ml/min。

22、麦芽浸粉在发酵制备重组人源化胶原蛋白中的应用。

23、根据本发明优选的，所述发酵的菌株为重组表达氨基酸序列如seq id no.1所示的人源化iii型胶原蛋白的大肠埃希氏菌col 1。

24、进一步优选的，所述大肠埃希氏菌col 1是以大肠埃希氏菌bl21(de3)为宿主菌构建得到的。

25、根据本发明优选的，所述麦芽浸粉是替代发酵基础培养基中的部分酵母浸粉参与到发酵工艺中。

26、进一步优选的，所述麦芽浸粉替代酵母浸粉的质量百分比为5-20％；进一步优选为10-20％。

27、有益效果：

28、本发明提供了一种提高重组人源化胶原蛋白生产水平的发酵工艺，是向含有酵母浸粉的发酵基础培养基中添加麦芽浸粉以替代部分酵母浸粉，构成发酵培养基，以发酵生产重组人源化胶原蛋白，所述麦芽浸粉替代酵母浸粉的质量百分比为5-20％。本发明使用三株不同基因型的大肠埃希氏菌col 1、col 2、col 3为发酵菌株，意外发现，大肠埃希氏菌col 1在该发酵工艺下，具有较快的发酵速度和较高的发酵产量，缩短发酵周期，总体成本降低25％以上，重组人源化胶原蛋白的表达量提高了15.38-115.38％，进一步提升了重组人源化胶原蛋白的生产水平。