一种功能增强型溶瘤病毒及制备方法与应用与流程

本发明涉及生物技术，具体涉及一种功能增强型溶瘤病毒及制备方法与应用。

背景技术：

1、白喉毒素(diphtheria toxin，dt)是一种生物毒素，由溶原噬菌体感染的白喉杆菌产生的一种包含535个氨基酸残基的单链蛋白。dt是一个“y”字型的蛋白结构，包含两个不同功能区域：a链区蛋白片段和b链区蛋白片段。a链区蛋白片段位于n端，是酶催化域(c-domain,氨基酸残基1-193)，在真核细胞中发挥终止蛋白质合成的作用。b链区蛋白片段位于c端，包含一个跨膜结构域(t-domain,氨基酸残基201-384)和一个受体结合域(r-domain,氨基酸残基385-455)，t-domain帮助c-domain从胞内体移位到细胞溶质，r-domain则负责与细胞表面肝素结合表皮生长因子受体(heparin-binding epidermal growthfactor receptor,hbegfr)结合。dt在细胞中其酶催化域c-domain首先结合烟酰胺二核苷酸(nad)，然后将nad分子的二磷酸腺苷核桃基(adenosine diphosphate ribosyl,adpr)转移到肽链延伸因子(elongation factor 2，ef2)上，使ef2不可逆的失活，从而抑制细胞内的蛋白质合成。masaru yamaizuni等人证明dt进入细胞内能够强烈抑制真核细胞的蛋白合成而导致细胞死亡，1～2个dt蛋白的c-domain片段引入细胞内就足以杀死该细胞。如此强烈的细胞毒性是大多数化学药物和化学毒物都没法与之匹敌。但是当dt去除r-domain后，截短的dt剩余部分无法进入细胞则几乎表现不出任何细胞毒性。由于dt容易表达、细胞致死活性高和改造后对人体毒副作用较小等优点，已经被广泛应用于抗肿瘤靶向药物的研发领域。其中基于dt的免疫毒素开发策略表现的最为突出，即将dt的受体结合域r-domain替换为具有靶向结合能力的抗体、抗体片段、细胞穿膜多肽、生长因子或者细胞因子等，形成的融合蛋白可特异性的杀灭肿瘤。

2、然而，免疫毒素的开发仍有多种不利因素，例如制备和纯化工艺复杂、生产成本高，并且容易引起患者体内的免疫反应降低治疗效果等。

3、为了规避dt免疫毒素生产、纯化、管理和免疫原性等方面的劣势，让dt的a链区域(dta)编码基因特异性地在肿瘤细胞中表达从而靶向杀伤肿瘤细胞，是基于dt抗肿瘤的另一种策略。研究人员已经开发出多种肿瘤特异性启动子控制dta基因在体内表达的重组质粒或病毒载体，通过肿瘤部位局部注射重组载体可有效抑制肿瘤生长。然而，质粒载体、慢病毒载体或腺病毒载体在递送dta基因时缺乏靶向性，会对正常细胞产生毒性。除此之外，携带dta基因的质粒在包装慢病毒或腺病毒时会遗漏表达，导致包装细胞或者扩增细胞死亡，而降低病毒产量。因此，肿瘤特异性递送载体和dta可控表达系统的应用是完善基于dta肿瘤治疗策略所必须的。

4、溶瘤病毒治疗是近年来恶性实体肿瘤最有前景的治疗策略之一。溶瘤病毒(oncolytic virus，ov)包括溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus，oa)、溶瘤痘苗病毒(oncolytic vaccinia virus)和溶瘤单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simplex virus)等，它们能够特异性的在肿瘤细胞中复制，从而杀灭肿瘤。癌症的靶向基因-病毒治疗(cancer-targeting gene-virotherapy，ctgvt)是2001年刘新垣团队提出增强溶瘤病毒抗肿瘤功效的新策略。ctgvt策略的核心是将一个或多个抗癌基因插入到溶瘤病毒载体，从而将病毒治疗和基因治疗有机结合，发挥协同抗肿瘤的作用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的缺陷与不足，规避蛋白类或多肽生物毒素的复杂制备工艺、高生产成本、免疫原性，以及表达蛋白类细胞毒素的基因载体的非特异性表达、非靶向性，本发明提供了一种功能增强型溶瘤病毒及制备方法与应用。

2、本发明采用的技术解决方案是：一种功能增强型溶瘤病毒，所述的溶瘤病毒的基因组包括诱导宿主细胞死亡的天然或人工设计基因编码的生物毒素或表达其功能的一种或多种核酸序列，所述的溶瘤病毒的基因组还包括可调控诱导宿主细胞死亡的天然或人工设计基因编码的生物毒素或其部分功能的一种或多种核酸序列表达的基因表达调控系统。

3、所述的生物毒素为诱导宿主细胞死亡的天然或人工设计基因编码的毒性蛋白或多肽类物质。

4、所述的生物毒素为白喉毒素或假单胞菌毒素。

5、所述的基因表达调控系统为在哺乳动物细胞内基因诱导表达系统的四环四诱导系统(tet-on)或他莫昔芬诱导系统。

6、所述的溶瘤病毒包括溶瘤腺病毒、溶瘤痘苗病毒或溶瘤单纯疱疹病毒中的一种。

7、所述的诱导宿主细胞死亡的天然或人工设计基因编码的生物毒素或表达其部分功能的一种或多种核酸序列为表达白喉毒素dt蛋白的dta基因。

8、所述的功能增强型溶瘤病毒内包含有携带dta基因和四环四诱导系统(tet-on)的psd55-tetone-dta质粒或pbatk-tetone-dta质粒，所述的psd55-tetone-dta质粒序列如seq id no.1所示，所述的pbatk-tetone-dta质粒序列如seq id no.2所示。

9、一种psd55-tetone-dta质粒的制备方法，包括以下步骤：先通过查询和设计dta-flag基因，再构建到ptetone载体的bamhi和psti酶切位点之间，或的ptetone-dta(flag)重组质粒，再以ptetone-dta(flag)为模版，设计上下游引物，pcr扩增tetone-dta(flag)表达框，并构建到psd55质粒的bglii酶切位点，从而获得psd55-tetone-dta重组质粒。

10、所述的设计dta-flag基因序列如seq id no.3所示。

11、所述的方法中含psd55质粒bglii酶切位点5’端同源臂的tetone-dta(flag)基因上游引物序列如seq id no.4所示，含psd55质粒bglii酶切位点3’端同源臂的tetone-dta(flag)基因下游引物序列如seq id no.5所示。

12、一种pbatk-tetone-dta质粒的制备方法，包括以下步骤：先通过查询和设计dta-flag基因，再构建tetone-dta(flag)重组质粒，再以tetone-dta(flag)为模版，设计上下游引物，pcr扩增tetone-dta(flag)表达框，并构建到pbatk质粒的sali和xhoi酶切位点，从而获得pbatk-tetone-dt重组质粒。

13、所述的方法中含pbatk质粒xhoi酶切位点5’端的tetone-dta(flag)基因上游引物序列如seq id no.6所示，含pbatk质粒sali酶切位点3’端的tetone-dta(flag)基因下游引物序列如seq id no.7所示。、

14、一种所述的功能增强型溶瘤病毒在制备抑制癌细胞侵袭、增殖、迁移药物上的应用。

15、一种所述的功能增强型溶瘤病毒在制备治疗癌症的靶向基因-病毒治疗药物上的应用。

16、本发明的有益效果是：本发明提供了一种功能增强型溶瘤病毒及制备方法与应用，该溶瘤病毒携带可调控dta基因表达的tet-on基因表达调控系统，病毒包装过程中tet-on系统保持关闭状态，从而避免溶瘤腺病毒包装和扩增过程中dta的表达对hek293细胞的“误伤”，溶瘤腺病毒注射治疗初期仍然保持tet-on系统关闭，待病毒在肿瘤内扩增一段时间后，通过强力霉素诱导感染病毒细胞内dta的表达，从而增强抗肿瘤功效，同时该方法降低病毒使用剂量，降低溶瘤病毒可能引起的不良反应，携带dta的溶瘤腺病毒治疗初期出现不了反应，可及时开启dta基因表达杀死感染初期的宿主细胞，有助于机体快速清除暴露的溶瘤腺病毒，从而起到降低溶瘤病毒治疗风险的作用，溶瘤腺病毒感染宿主肿瘤细胞范围广，可将dta基因递送至绝大部分肿瘤，因此可增强广谱抗肿瘤作用。