昆虫细胞及其工程化的方法与流程

背景技术：

1、生物制剂市场诸如像基因和细胞疗法正在扩大，但目前承受着高制造成本和与扩大生产相关的困难的负担。持续需要改善的细胞系和分离它们的方法，用于包括但不限于生物制剂生产和病毒载体生产的应用。

技术实现思路

1、本公开尤其提供了用于在昆虫细胞中产生和/或表达病毒载体的方法、系统和组合物。本公开认识到，用于在昆虫细胞中表达病毒载体的现有技术承受着低效的病毒生产和低效的分离优化的昆虫细胞系的筛选的负担。本公开提供了用于工程化昆虫细胞和/或病毒载体以获得改变的与病毒载体生产相关的特征和其他特征的平台技术。在一些实施方案中，提供的方法使产生和/或选择具有改善的病毒载体表达和/或生产特征(例如，增加的病毒载体表达、增加的表达持续时间、增加的稳定性等)的昆虫细胞系成为可能。在一些实施方案中，方法包括筛选由具有标识符的昆虫细胞的文库产生的病毒载体。提供的技术包括令人惊讶的见解，即使病毒载体获取表达其的昆虫细胞的标识符(例如，包括条形码序列和/或文库变体)，从而使文库中细胞的病毒载体产生能力的有效评估、表征和/或鉴定成为可能。例如，在一些实施方案中，昆虫细胞群各自用文库构建体转化，所述文库构建体包含标识符，具有适合于将标识符包装到病毒载体中的结构(例如，对于aav载体，标识符可以位于aav itr之间)。在一些实施方案中，可以通过丰富的独特标识符来筛选、选择和/或表征由此类昆虫细胞群产生的病毒载体池。

2、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个工程化序列的昆虫细胞，所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)至少一个位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符，和(ii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中昆虫细胞产生包含至少一个标识符的病毒载体。

3、在一些实施方案中，由昆虫细胞产生的病毒载体包含与产生病毒载体的昆虫细胞的标识符相同的标识符。在一些实施方案中，病毒载体的标识符源自产生病毒载体的昆虫细胞的标识符。在一些实施方案中，病毒载体的标识符对应于产生病毒载体的昆虫细胞的标识符。在一些实施方案中，病毒载体的标识符与产生病毒载体的昆虫细胞的标识符至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同。

4、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个工程化序列的昆虫细胞，所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)至少一个位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符，(ii)至少一个扰动，和(iii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中昆虫细胞产生包含至少一个标识符的病毒载体。在一些实施方案中，昆虫细胞还包含有效载荷和/或至少一个文库变体。在一些实施方案中，昆虫细胞还包含至少一个扰动附加序列。

5、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个工程化序列的昆虫细胞，所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)至少一个位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符，(ii)至少一个文库变体，和(iii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中昆虫细胞产生包含至少一个标识符的病毒载体。在一些实施方案中，昆虫细胞还包含有效载荷和/或至少一个扰动。在一些实施方案中，昆虫细胞还包含至少一个扰动附加序列。

6、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个工程化序列的昆虫细胞，所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)至少一个位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符，(ii)至少一个有效载荷，和(iii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中昆虫细胞产生包含至少一个标识符的病毒载体。在一些实施方案中，昆虫细胞还包含至少一个文库变体和/或至少一个扰动。在一些实施方案中，昆虫细胞还包含至少一个扰动附加序列。

7、在一些实施方案中，昆虫细胞还包含至少一个反式作用整合序列和/或至少一个顺式作用整合序列。

8、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个工程化序列的昆虫细胞，所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)至少一个位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符；(ii)至少一个文库变体和/或扰动；(iii)至少一个有效载荷；(iv)至少一个扰动附加序列；(v)至少一个反式作用整合序列和/或至少一个顺式作用整合序列；和(vi)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中昆虫细胞产生包含至少一个标识符的病毒载体。

9、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个工程化序列的昆虫细胞，所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)至少一个位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符；(ii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸；以及任选的(iii)一个或多个包含至少一个扰动、至少一个文库变体、至少一个有效载荷、至少一个扰动附加序列、至少一个反式作用整合序列，和/或至少一个顺式作用整合序列的工程化序列，并且其中昆虫细胞产生包含至少一个标识符的病毒载体。

10、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个工程化序列的昆虫细胞，所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)文库构建体，和(ii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中所述文库构建体包含标识符，其中所述标识符位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间，并且其中昆虫细胞产生包含所述标识符的病毒载体。在一些实施方案中，昆虫细胞任选地还包含一个或多个工程化序列，所述一个或多个工程化序列包含：至少一个扰动、至少一个文库变体、至少一个有效载荷、至少一个扰动附加序列、至少一个反式作用整合序列，和/或至少一个顺式作用整合序列，并且其中昆虫细胞产生包含至少一个标识符的病毒载体。

11、在一些实施方案中，由昆虫细胞产生的病毒载体包含与文库构建体相同的标识符。在一些实施方案中，病毒载体的标识符源自相关文库构建体的标识符。在一些实施方案中，病毒载体的标识符对应于文库构建体的标识符。在一些实施方案中，病毒载体的标识符与文库构建体的标识符至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同。

12、在一些实施方案中，提供了包含一个或多个工程化序列的昆虫细胞，所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)文库构建体，和(ii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中所述文库构建体包含标识符，其中所述标识符位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间，并且其中昆虫细胞产生包含所述标识符的病毒载体。在一些实施方案中，文库构建体任选地还包含一个或多个工程化序列，所述一个或多个工程化序列包含至少一个文库变体和/或至少一个有效载荷。在一些实施方案中，昆虫细胞任选地还包含一个或多个工程化序列，所述一个或多个工程化序列包含：至少一个扰动、至少一个扰动附加序列、至少一个反式作用整合序列，和/或至少一个顺式作用整合序列，并且其中昆虫细胞产生包含至少一个标识符的病毒载体。

13、在一些实施方案中，提供了包含多个昆虫细胞的昆虫细胞群，所述多个昆虫细胞各自单独地包含一个或多个工程化序列，其中所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)至少一个位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符，(ii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，并且其中昆虫细胞群产生单独地包含至少一个标识符的病毒载体。在一些实施方案中，昆虫细胞群任选地还包含一个或多个工程化序列，所述一个或多个工程化序列包含：至少一个扰动、至少一个文库变体、至少一个有效载荷、至少一个扰动附加序列、至少一个反式作用整合序列，和/或至少一个顺式作用整合序列。

14、在一些实施方案中，提供了包含多个昆虫细胞的昆虫细胞群，所述多个昆虫细胞各自单独地包含一个或多个工程化序列，其中所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)至少一个位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符，(ii)至少一个文库变体和/或扰动，(iii)至少一个有效载荷，和(iv)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中昆虫细胞群产生单独地包含至少一个标识符的病毒载体。在一些实施方案中，昆虫细胞任选地还包含一个或多个工程化序列，所述一个或多个工程化序列包含：至少一个扰动附加序列、至少一个反式作用整合序列，和/或至少一个顺式作用整合序列。

15、在一些实施方案中，提供了包含多个昆虫细胞的昆虫细胞群，所述多个昆虫细胞各自单独地包含一个或多个工程化序列，其中所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)文库构建体和(ii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中文库构建体包含位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符，并且其中昆虫细胞群产生单独地包含标识符的病毒载体。在一些实施方案中，昆虫细胞群任选地还包含一个或多个工程化序列，所述一个或多个工程化序列包含：至少一个扰动、至少一个文库变体、至少一个有效载荷、至少一个扰动附加序列、至少一个反式作用整合序列，和/或至少一个顺式作用整合序列。

16、在一些实施方案中，提供了包含多个昆虫细胞的昆虫细胞群，所述多个昆虫细胞各自单独地包含一个或多个工程化序列，其中所述一个或多个工程化序列共同包含：(i)文库构建体和(ii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中文库构建体包含位于能够包装到病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符，并且其中昆虫细胞群产生单独地包含标识符的病毒载体。在一些实施方案中，文库构建体任选地还包含一个或多个工程化序列，所述一个或多个工程化序列包含至少一个文库变体和/或至少一个有效载荷。在一些实施方案中，昆虫细胞群任选地还包含一个或多个工程化序列，所述一个或多个工程化序列包含：至少一个扰动、至少一个扰动附加序列、至少一个反式作用整合序列，和/或至少一个顺式作用整合序列。

17、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含扰动(例如，一个或多个扰动)。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞产生包含扰动(例如，一个或多个扰动)的病毒载体。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含扰动(例如，一个或多个扰动)，所述昆虫细胞也产生包含扰动(例如，一个或多个扰动)的病毒载体。在一些实施方案中，至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸包含扰动(例如，一个或多个扰动)。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含扰动(例如，一个或多个扰动)，并且至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸包含扰动(例如，一个或多个扰动)。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞产生包含扰动(例如，一个或多个扰动)的病毒载体，并且至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸包含扰动(例如，一个或多个扰动)。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含扰动(例如，一个或多个扰动)，所述昆虫细胞也产生包含扰动(例如，一个或多个扰动)的病毒载体，并且至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸包含扰动(例如，一个或多个扰动)。

18、昆虫细胞和/或昆虫细胞群可包括本领域适合于表达病毒载体的任何昆虫细胞。在一些实施方案中，昆虫细胞是来自或源自粘虫(例如，草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda))、果蝇(例如，果蝇属(drosophila))或蚊子(例如，白纹伊蚊(aedesalbopictus))的细胞。

19、在一些实施方案中，昆虫细胞包括sf21细胞、sf9细胞、bti-tn-5b1-4(high five)细胞、s2细胞、d.mel2细胞或其任意的衍生物。在一些实施方案中，昆虫细胞包括sf9细胞和/或其衍生物。

20、在一些实施方案中，昆虫细胞适用于悬浮细胞培养。在一些实施方案中，昆虫细胞适用于贴壁细胞培养。在一些实施方案中，昆虫细胞群可以包含悬浮细胞和/或贴壁细胞中的细胞。

21、本公开的昆虫细胞和/或方法可以用于产生任何病毒载体。在一些实施方案中，由本公开的昆虫细胞和/或方法产生的病毒载体包含扰动(例如，一个或多个扰动)。在一些实施方案中，扰动改变一个或多个与产生病毒载体相关的特征(例如，病毒载体稳定性等)或其他特征(例如，改变的治疗活性等)。

22、在一些实施方案中，昆虫细胞文库的昆虫细胞已经被修饰以破坏或去除产生的病毒载体的受体。在一些实施方案中，昆虫细胞已经用阻断病毒载体感染的剂处理。

23、在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(aav)载体、杆状病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、α病毒载体、辛德毕斯病毒载体、逆转录病毒载体(例如，γ逆转录病毒载体)、多瘤病毒载体(例如，猴病毒40(sv40)载体)、乳头瘤病毒载体(例如，牛乳头瘤病毒(bpv)载体)、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒(hsv)载体、麻疹病毒载体、棒状病毒载体、狂犬病病毒载体、水疱性口炎病毒(vsv)载体、小核糖核酸病毒载体(例如，脊髓灰质炎病毒载体)、呼肠孤病毒载体、塞内卡病毒载体、艾柯病毒(echovirus)载体(例如，rigvir)、塞姆利基森林病毒(sfv)载体、黄病毒载体、指环病毒载体、新城疫病毒(ndv)载体、副粘病毒载体、仙台病毒载体、正粘病毒载体、流感病毒载体、冠状病毒载体和/或杂交病毒载体，和/或其衍生物、杂交体和/或工程化衍生物。

24、在一些实施方案中，本文提供的昆虫细胞、昆虫细胞群和/或方法可用于表达腺相关病毒(aav)载体。在一些实施方案中，昆虫细胞包含(i)至少一个位于能够包装到aav载体中的两个病毒重复序列之间的标识符和(ii)至少一个包含一个或多个产生aav载体所必需的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，两个病毒重复序列各自是能够包装到aav载体中的aav itr序列。在一些实施方案中，两个病毒重复序列各自是昆虫aav itr序列。在一些实施方案中，两个病毒重复序列各自是人aav itr序列。

25、在一些实施方案中，提供了包含多个昆虫细胞的昆虫细胞群，其中多个中的每个昆虫细胞包含：(i)核酸序列，其包含位于两个功能性aav itr序列之间的条形码，其中所述核酸序列被整合至位于一对顺式作用整合序列之间的昆虫基因组中，(ii)一个或多个文库变体，其导致一个或多个扰动，和(iii)一个或多个产生aav载体所必需的核酸序列，其中昆虫细胞群产生多个aav载体，其中每个aav载体包含对应于产生它的昆虫细胞的条形码的条形码。在一些实施方案中，至少一个文库变体包含grna，并且所述昆虫细胞还包含rna引导的核酸酶。在一些实施方案中，由昆虫细胞产生的aav载体还包含有效载荷。

26、在一些实施方案中，昆虫细胞的顺式作用整合序列是源自无脊椎动物病毒(例如，鹿眼蛱蝶浓核病毒(junonia coenia densovirus)(jcdnv))的病毒重复序列。在一些实施方案中，昆虫细胞的顺式作用整合序列是重组酶识别位点。

27、在一些实施方案中，相对于缺乏一个或多个扰动的参考昆虫细胞群，昆虫细胞的一个或多个扰动与aav产生和/或aav分泌的增加相关。在一些实施方案中，相对于缺乏一个或多个扰动的参考昆虫细胞，包含一个或多个扰动的昆虫细胞具有至少10％的aav产生和/或aav分泌增加。

28、在一些实施方案中，本文所述的昆虫细胞和/或文库构建体的两个病毒重复序列包含一对反向末端重复序列(itr)，其是或包括人aav1 itr；人aav2 itr；人aav3bitr；人aav4 itr；人aav5 itr；人aav6 itr；人aav7 itr；人aav8 itr；人aav9 itr；人aav10 itr；人aav11 itr；人aav12 itr；人aav13 itr，或其任何组合。

29、在一些实施方案中，本文所述的昆虫细胞和/或文库构建体的两个病毒重复序列包含一对反向末端重复序列(itr)，其是或包括牛aav(b-aav)itr；犬aav(caav)itr；小鼠aav1 itr；山羊aav itr；大鼠aav itr；或禽aav(aaav)itr。

30、在一些实施方案中，昆虫细胞包含一个或多个多核苷酸，其编码一个或多个产生aav载体所必需的蛋白质，诸如aav衣壳蛋白。在一些实施方案中，aav载体包含人aav1衣壳蛋白；人aav2衣壳蛋白；人aav3b衣壳蛋白；人aav4衣壳蛋白；人aav5衣壳蛋白；人aav6衣壳蛋白；人aav7衣壳蛋白；人aav8衣壳蛋白；人aav9衣壳蛋白；人aav10衣壳蛋白；人aav11衣壳蛋白；人aav12衣壳蛋白；或人aav13衣壳蛋白。在一些实施方案中，aav载体包含人祖先aav衣壳蛋白。在一些实施方案中，aav载体包含牛aav(b-aav)衣壳蛋白；犬aav(caav)衣壳蛋白；小鼠aav1衣壳蛋白；山羊aav衣壳蛋白；大鼠aav衣壳蛋白；或禽aav(aaav)衣壳蛋白。

31、在一些实施方案中，本文提供的昆虫细胞、昆虫细胞群和/或方法可用于表达aav载体，其中昆虫细胞包含(i)包含至少一个位于能够包装到aav载体中的两个aav itr序列之间的标识符的文库构建体，和(ii)至少一个包含一个或多个产生aav载体所必需的选自rep基因、cap基因、辅助基因或其组合的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，至少一个包含一个或多个形成aav载体所必需的核酸序列的多核苷酸包含：aav rep基因、aav cap基因、一个或多个aav辅助基因或其组合。在一些实施方案中，aav载体具有复制能力。在一些实施方案中，aav载体是条件复制的、复制缺乏的、无复制能力的和/或复制缺陷的。

32、在一些实施方案中，本文提供的昆虫细胞、昆虫细胞群和/或方法可用于表达杆状病毒载体(例如，苜蓿银纹夜蛾(autographa californica)多核型多角体病毒(acmnpv)载体)。

33、在一些实施方案中，本文提供的昆虫细胞、昆虫细胞群和/或方法可用于表达慢病毒载体。在一些实施方案中，昆虫细胞包含(i)至少一个位于能够包装到慢病毒载体中的两个病毒重复序列之间的标识符和(ii)至少一个包含一个或多个产生慢病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，两个病毒重复序列各自是能够包装到慢病毒载体中的慢病毒ltr序列。

34、在一些实施方案中，本文所述的昆虫细胞和/或文库构建体的两个病毒重复序列包含一对ltr，其包括hiv ltr、siv ltr、马传染性贫血病毒ltr、fiv ltr、维斯纳病毒ltr，或其衍生物或组合。在一些特定的实施方案中，慢病毒载体是hiv载体并且ltr是hiv ltr或其衍生物。在一些实施方案中，慢病毒载体包含慢病毒psi序列。

35、在一些实施方案中，提供了包含多个昆虫细胞的昆虫细胞群，其中多个中的每个昆虫细胞包含：(i)核酸序列，包含位于两个功能性慢病毒ltr序列之间的条形码，其中所述核酸序列被整合至位于一对顺式作用整合序列之间的昆虫基因组中，(ii)一个或多个文库变体，其导致一个或多个扰动，和(iii)一个或多个产生慢病毒载体所必需的核酸序列，其中昆虫细胞群产生多个慢病毒载体，其中每个慢病毒载体包含对应于产生它的昆虫细胞的条形码的条形码。在一些实施方案中，至少一个文库变体包含grna，并且所述昆虫细胞还包含rna引导的核酸酶。在一些实施方案中，由昆虫细胞产生的慢病毒载体还包含有效载荷。

36、在一些实施方案中，昆虫细胞的顺式作用整合序列是源自慢病毒的病毒重复序列。在一些实施方案中，昆虫细胞的顺式作用整合序列是重组酶识别位点。

37、在一些实施方案中，慢病毒ltr包括hiv ltr、siv ltr、马传染性贫血病毒ltr、fivltr、维斯纳病毒ltr或其衍生物或组合。在一些特定的实施方案中，慢病毒载体是hiv载体并且ltr是hiv ltr或其衍生物。在一些实施方案中，慢病毒载体包含慢病毒psi序列。

38、在一些实施方案中，相对于缺乏一个或多个扰动的参考昆虫细胞群，昆虫细胞的一个或多个扰动与慢病毒载体产生和/或慢病毒载体分泌的增加相关。在一些实施方案中，相对于缺乏一个或多个扰动的参考昆虫细胞，包含一个或多个扰动的昆虫细胞具有至少10％的慢病毒载体产生和/或慢病毒载体分泌增加。

39、在一些实施方案中，由本公开的昆虫细胞和方法表达的慢病毒载体是人免疫缺陷病毒(hiv)载体、猴免疫缺陷病毒(siv)载体、马传染性贫血病毒载体、猫免疫缺陷病毒(fiv)载体、维斯纳病毒载体或其衍生物。

40、在一些实施方案中，昆虫细胞包含一个或多个多核苷酸，其编码一个或多个产生慢病毒载体所必需的蛋白质，诸如慢病毒gag蛋白或其片段。在一些实施方案中，gag蛋白包含一个或多个选自基质(ma)、衣壳(ca)和核衣壳(nc)结构域的结构域。在一些实施方案中，昆虫细胞包含一个或多个多核苷酸，其编码一个或多个产生慢病毒载体所必需的蛋白质，诸如慢病毒包膜蛋白或其片段。

41、在一些实施方案中，慢病毒载体是包含源自不同病毒的gag蛋白和包膜蛋白的假型慢病毒载体。在一些实施方案中，昆虫细胞包含一个或多个编码一个或多个产生假型慢病毒载体所必需的蛋白质的多核苷酸，所述假型慢病毒载体包含源自人免疫缺陷病毒(hiv)载体、猴免疫缺陷病毒(siv)载体、马传染性贫血病毒载体、猫免疫缺陷病毒载体、维斯纳病毒载体或其衍生物的gag蛋白和/或env蛋白。

42、在一些实施方案中，本文提供的昆虫细胞、昆虫细胞群和/或方法可用于表达慢病毒载体，其中昆虫细胞包含(i)包含至少一个位于两个慢病毒ltr和/或psi序列之间的标识符的文库构建体，所述序列能够包装到慢病毒载体中，和(ii)至少一个包含一个或多个产生慢病毒载体所必需的选自gag基因、env基因、pol基因或其组合的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，至少一个包含一个或多个形成慢病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸包含：慢病毒gag基因、慢病毒env基因、慢病毒pol基因或其组合。在一些实施方案中，慢病毒载体具有复制能力。在一些实施方案中，慢病毒载体是条件复制的、复制缺乏的、无复制能力的和/或复制缺陷的。

43、在一些实施方案中，至少一个包含一个或多个形成慢病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸包含：hiv gag基因、hiv env基因、hiv pol基因或其组合。在一些实施方案中，慢病毒载体是具有复制能力的hiv载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是条件复制的、复制缺乏的、无复制能力的和/或复制缺陷的hiv载体。

44、在一些实施方案中，昆虫细胞已经先前或同时被遗传修饰以破坏或去除慢病毒的受体。在一些实施方案中，昆虫细胞已经用阻断慢病毒载体感染的剂处理。在此类实施方案中，整合载体和/或顺式作用整合序列不源自慢病毒。

45、在一些实施方案中，本文提供的昆虫细胞、昆虫细胞群和/或方法可用于表达单纯疱疹病毒(hsv)载体。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含(i)至少一个位于能够包装到hsv载体中的两个病毒重复序列之间的标识符和(ii)至少一个包含一个或多个产生hsv载体所必需的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，hsv载体是或源自单纯疱疹病毒-1(hsv-1)、单纯疱疹病毒-2(hsv-2)、人巨细胞病毒(hcmv)、水痘-带状疱疹病毒(vzv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(kshv)、人疱疹病毒6和/或人疱疹病毒7和/或其衍生物。

46、在一些实施方案中，本文所述的昆虫细胞和/或文库构建体的两个病毒重复序列包含末端a序列。

47、在一些实施方案中，昆虫细胞包含一个或多个多核苷酸，其编码一个或多个产生hsv载体所必需的蛋白质，诸如hsv衣壳蛋白或其片段。在一些实施方案中，hsv衣壳包含vp5、vp19c、vp23、pre-vp22a和/或成熟的蛋白酶(ul26基因产物)。

48、在一些实施方案中，本文提供的昆虫细胞、昆虫细胞群和/或方法可用于表达hsv载体，其中昆虫细胞包含(i)包含至少一个位于hsv末端a序列之间的标识符的文库构建体，所述序列能够包装到hsv载体中，和(ii)至少一个包含一个或多个产生包含hsv衣壳蛋白的hsv载体所必需的核酸序列的多核苷酸。

49、在一些实施方案中，本文提供的昆虫细胞、昆虫细胞群和/或方法可用于表达hsv-aav杂交载体。在一些实施方案中，hsv-aav杂交载体具有复制能力。在一些实施方案中，hsv-aav杂交载体是条件复制的、复制缺乏的、无复制能力的和/或复制缺陷的。

50、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含一个或多个多核苷酸，所述一个或多个多核苷酸包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列。在一些实施方案中，包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸游离存在于昆虫细胞中。在一些实施方案中，包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸存在于昆虫细胞基因组中。在一些实施方案中，一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列包含异源性调控元件(例如，异源性启动子和/或异源性增强子)。在一些实施方案中，一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列包含异源性启动子序列，所述异源性启动子序列是或包括sv40启动子、延伸因子(ef)-1启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、磷酸甘油酸激酶(pgk)1启动子、泛素(ubc)启动子、人β肌动蛋白启动子、四环素反应元件(tre)启动子、脾灶形成病毒(sffv)启动子、鼠干细胞病毒(mscv)启动子、超级核心启动子(scp)、cag启动子或其衍生物。在一些实施方案中，一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列包含异源性增强子序列，其是或包括cmv早期增强子、camp反应元件(cre)增强子或其衍生物。在一些实施方案中，一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列处于诱导型转录控制元件的控制之下。在一些实施方案中，一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列可以整合到昆虫细胞基因组中并处于诱导型转录控制元件(例如，诱导型启动子和/或诱导型增强子)的控制之下。在一些实施方案中，一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列可以游离存在于昆虫细胞中并处于诱导型转录控制元件(例如，诱导型启动子和/或诱导型增强子)的控制之下。

51、本公开的昆虫细胞和/或昆虫细胞群的任何工程化序列可以游离存在和/或整合到昆虫细胞基因组中。在一些实施方案中，一个或多个工程化序列可以游离存在于昆虫细胞中，包括但不限于：标识符、扰动、文库变体、有效载荷、扰动附加序列、反式作用整合序列，和/或顺式作用整合序列。在一些实施方案中，一个或多个工程化序列可以整合到昆虫细胞基因组中，包括但不限于：标识符、扰动、文库变体、有效载荷、扰动附加序列、反式作用整合序列，和/或顺式作用整合序列。

52、在一些实施方案中，一个或多个工程化序列存在于病毒载体中(例如，标识符、扰动、有效载荷等)。在一些实施方案中，昆虫细胞和/或昆虫细胞群表达各自包含标识符和扰动的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体包含改变与病毒载体产生相关的一个或多个特征和/或其他特征(例如，稳定性等)的扰动。在一些实施方案中，病毒载体还包含有效载荷。在一些实施方案中，病毒载体还包含报告基因和/或选择标记。

53、在一些实施方案中，昆虫细胞包含文库构建体，其中构成文库构建体的一个或多个多核苷酸可以游离存在于昆虫细胞中，包括但不限于：标识符、文库变体、有效载荷、扰动附加序列、反式作用整合序列，和/或顺式作用整合序列。在一些实施方案中，昆虫细胞包含文库构建体，其中构成文库构建体的一个或多个多核苷酸可以整合到昆虫细胞中，包括但不限于：标识符、文库变体、有效载荷、扰动附加序列、反式作用整合序列，和/或顺式作用整合序列。在一些实施方案中，构成文库构建体的一个或多个多核苷酸可以以低拷贝数整合到昆虫细胞中，例如四个拷贝或更少、三个拷贝或更少、两个拷贝或更少，或单个拷贝。

54、在一些实施方案中，一个或多个工程化序列包含异源性编码序列。在一些实施方案中，一个或多个工程化序列包含异源性基因和/或异源性基因区段。在一些实施方案中，一个或多个工程化序列包含异源性调控元件(例如，异源性启动子和/或异源性增强子)。在一些实施方案中，一个或多个工程化序列包含异源性启动子序列，所述异源性启动子序列是或包括sv40启动子、延伸因子(ef)-1启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、磷酸甘油酸激酶(pgk)1启动子、泛素(ubc)启动子、人β肌动蛋白启动子、四环素反应元件(tre)启动子、脾灶形成病毒(sffv)启动子、鼠干细胞病毒(mscv)启动子、超级核心启动子(scp)、cag启动子或其衍生物。在一些实施方案中，一个或多个工程化序列包含异源性增强子序列，所述异源性增强子序列是或包括cmv早期增强子、camp反应元件(cre)增强子或其衍生物。在一些实施方案中，一个或多个工程化序列包含诱导型转录控制元件。

55、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含多于一个工程化序列(例如，标识符、扰动、文库变体、有效载荷、扰动附加序列、反式作用整合序列，和/或顺式作用整合序列)。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个，或十个或更多个工程化序列。在一些实施方案中，昆虫细胞包含多至100个工程化序列。

56、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含有包含一个或多个工程化序列的文库构建体，所述一个或多个工程化序列可以包括例如：标识符、文库变体、有效载荷、扰动附加序列、反式作用整合序列，和/或顺式作用整合序列。在一些实施方案中，本公开的昆虫细胞包含至少一个文库构建体，其中所述至少一个文库构建体包含至少一个工程化序列。在一些实施方案中，文库构建体包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个，或十个或更多个工程化序列。在一些实施方案中，文库构建体包含多至100个工程化序列。

57、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生包含一个或多个工程化序列的病毒载体，所述一个或多个工程化序列可以包括例如：标识符、扰动、有效载荷，和/或顺式作用整合序列。

58、在一些实施方案中，本公开的昆虫细胞包含至少一个文库构建体，所述文库构建体包含至少一个选自以下的工程化序列：至少一个条形码、至少一个标识符、至少一个文库变体、至少一个有效载荷、至少一个顺式作用整合序列，或其组合和/或其多个。

59、在一些实施方案中，昆虫细胞包含至少一个包含条形码的工程化序列。在一些实施方案中，条形码包含约5至约25个核苷酸的序列。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含多个独特的条形码，并且其中所述多个独特的条形码包含约5至约25个核苷酸的独特序列。

60、在一些实施方案中，文库构建体包含至少一个条形码。在一些实施方案中，文库构建体包含标识符，所述标识符包含至少一个条形码。在一些实施方案中，文库构建体包含标识符，所述标识符包含至少一个条形码，其中条形码位于两个病毒重复序列之间。在一些实施方案中，条形码位于两个病毒重复序列之间并且不是标识符。在一些实施方案中，条形码不位于两个病毒重复序列之间。

61、在一些实施方案中，昆虫细胞包含至少一个包含文库变体的工程化序列。文库变体可以包括但不限于包含基因、orf、grna序列、非编码核酸或其组合的工程化序列。在一些实施方案中，昆虫细胞包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个文库变体。在一些实施方案中，昆虫细胞包含多至100个文库变体。

62、在一些实施方案中，昆虫细胞包含多个文库变体，其中所述多个文库变体包含至少一个工程化序列，所述至少一个工程化序列包含：至少一个独特基因、至少一个独特orf、至少一个独特grna序列，和/或至少一个独特非编码核酸或其组合和/或多个。在一些实施方案中，昆虫细胞包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含：至少一个独特基因、至少一个独特orf、至少一个独特grna序列、至少一个独特非编码核酸序列或其组合和/或多个。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含多个独特基因、多个独特orf、多个独特grna序列、多个独特非编码核酸序列或其组合。

63、在一些实施方案中，文库构建体包含grna序列。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含至少一个独特grna序列。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含至少100个独特grna序列。

64、在一些实施方案中，文库构建体包含orf。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含至少一个独特orf。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含至少100个独特orf。

65、在一些实施方案中，文库构建体包含基因。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含至少一个独特基因。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含至少100个独特基因。

66、在一些实施方案中，文库构建体包含非编码核酸序列。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体各自包含至少一个独特非编码核酸序列。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含至少100个独特非编码核酸序列。

67、在一些实施方案中，文库构建体包含至少一个报告基因和/或选择标记。在一些实施方案中，一个或多个包含文库构建体的多核苷酸包含报告基因和/或选择标记。

68、在一些实施方案中，文库构建体包含标识符。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中所述多个文库构建体包含多个标识符。在一些实施方案中，标识符包含至少一个条形码和/或至少一个文库变体。在一些实施方案中，昆虫细胞包含有包含标识符的文库构建体，所述标识符包含至少一个条形码和/或至少一个文库变体。在一些实施方案中，昆虫细胞群包含多个包含多个标识符的文库构建体，其中所述标识符包含多个条形码和/或多个文库变体。

69、在一些实施方案中，文库构建体包含多个工程化序列，其中：多个工程化序列的第一子集位于两个病毒重复序列之间，并且多个工程化序列的第二子集位于两个病毒重复序列之外。

70、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含多个包含至少一个文库变体和至少一个标识符的工程化序列，其中至少一个文库变体和至少一个标识符都位于两个病毒重复序列之间。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含多个包含以下的工程化序列：至少一个文库变体、至少一个标识符和至少一个有效载荷，其中所述至少一个文库变体、至少一个标识符和至少一个有效载荷位于两个病毒重复序列之间。

71、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含多个包含至少一个文库变体和至少一个标识符的工程化序列，并且其中至少一个标识符位于两个病毒重复序列之间，并且其中至少一个文库变体位于两个病毒重复序列之外。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含多个包含至少一个文库变体、至少一个标识符和至少一个有效载荷的工程化序列，其中所述至少一个标识符和至少一个有效载荷位于两个病毒重复序列之间，并且其中所述至少一个文库变体位于两个病毒重复序列之外。

72、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含多个包含至少两个文库变体和至少一个标识符的工程化序列，其中所述至少一个标识符和至少两个文库变体中的至少一个文库变体位于两个病毒重复序列之间，并且其中所述至少两个文库变体中的至少一个文库变体位于两个病毒重复序列之外。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞还包含位于两个病毒重复序列之间的有效载荷。

73、在一些实施方案中，提供的文库构建体包含至少一个文库变体和至少一个标识符，其中所述至少一个文库变体和至少一个标识符都位于两个病毒重复序列之间。在一些实施方案中，提供的文库构建体包含：至少一个文库变体、至少一个标识符和至少一个有效载荷，其中所述至少一个文库变体、至少一个标识符和至少一个有效载荷位于两个病毒重复序列之间。

74、在一些实施方案中，提供的文库构建体包含至少一个文库变体和至少一个标识符，并且其中至少一个标识符位于两个病毒重复序列之间，并且其中至少一个文库变体位于两个病毒重复序列之外。在一些实施方案中，提供的文库构建体包含至少一个文库变体、至少一个标识符和至少一个有效载荷，其中所述至少一个标识符和至少一个有效载荷位于两个病毒重复序列之间，并且其中所述至少一个文库变体位于两个病毒重复序列之外。

75、在一些实施方案中，提供的文库构建体包含至少两个文库变体和至少一个标识符，其中所述至少一个标识符和至少两个文库变体中的至少一个文库变体位于两个病毒重复序列之间，并且其中所述至少两个文库变体中的至少一个文库变体位于两个病毒重复序列之外。在一些实施方案中，提供的文库构建体还包含位于两个病毒重复序列之间的有效载荷。

76、在一些实施方案中，至少一个标识符包含条形码。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少一个包含至少一个条形码的工程化序列，并且其中所述至少一个条形码位于两个病毒重复序列之间。在一些实施方案中，位于两个病毒重复序列之间的条形码是标识符。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少一个包含至少一个条形码的工程化序列，并且其中所述至少一个条形码位于两个病毒重复序列之外。

77、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含多个条形码。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含多个条形码，其中至少一个条形码位于两个病毒重复序列之间。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含多个条形码，其中多个条形码位于两个病毒重复序列之间。在一些实施方案中，位于两个病毒重复序列之间的至少一个条形码是标识符。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含多个条形码，其中多个条形码的第一子集位于两个病毒重复序列之间，并且多个条形码的第二子集位于两个病毒重复序列之外。

78、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体或其一部分的多于一个拷贝。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体或其一部分的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拷贝。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体或其一部分的多个拷贝。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体或其一部分的一个至四个拷贝。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞确切包含文库构建体或其一部分的两个拷贝。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞确切包含文库构建体或其一部分的一个拷贝。

79、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含至少一个由单个连续核酸序列组成的文库构建体。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中每个单独的文库构建体由单个连续核酸序列组成，并且其中多个文库构建体包含多个独特核酸序列。在一些实施方案中，文库构建体包含多于一个不连续核酸序列。在一些实施方案中，文库构建体包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个不连续核酸序列。在一些实施方案中，文库构建体包含多至100个不连续核酸序列。

80、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中每个单独的文库构建体由不连续核酸序列组成，并且其中文库构建体包含多个独特核酸序列。在一些实施方案中，源自每个单独的昆虫细胞的核酸或其衍生物在单细胞测序方法过程中包含至少一个独特的细胞身份序列。在一些实施方案中，源自每个单独的昆虫细胞的多于一个核酸序列或其衍生物在单细胞测序方法过程中包含细胞身份序列。在一些实施方案中，源自每个单独的文库构建体的核酸或其衍生物在单细胞测序方法过程中包含至少一个独特的细胞身份序列。在一些实施方案中，源自每个单独的文库构建体的多于一个核酸序列或其衍生物在单细胞测序方法过程中包含细胞身份序列。

81、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞群包含多个文库构建体，其中每个昆虫细胞包含单个文库构建体，所述单个文库构建体由多个不连续核酸序列组成，并且其中文库构建体包含多个独特核酸序列，并且其中来自文库构建体的多于一个核酸序列(或其衍生物)在单细胞测序方法过程中包含细胞身份序列。在一些实施方案中，来自文库构建体的所有核酸序列(或其衍生物)在单细胞测序方法过程中包含细胞身份序列。

82、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或病毒载体包含至少一个包含至少一个扰动的工程化序列。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含至少一个游离存在于昆虫细胞中的扰动。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含至少一个存在于昆虫细胞的基因组中的扰动。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含至少两个扰动，其中至少一个扰动游离存在并且至少一个扰动存在于昆虫细胞的基因组中。

83、在一些实施方案中，由本文提供的昆虫细胞表达的病毒载体包含扰动(例如，一个或多个扰动)。在一些实施方案中，病毒载体包含工程化序列，所述工程化序列包含存在于病毒核酸中的扰动。在一些实施方案中，病毒载体包含工程化序列，所述工程化序列包含存在于itr中的扰动。在一些实施方案中，病毒载体包含工程化序列，所述工程化序列包含存在于itr之间的扰动。

84、在一些实施方案中，形成病毒载体所必需的一个或多个多核苷酸包含有包含扰动(例如，一个或多个扰动)的工程化序列。在一些实施方案中，形成病毒载体所必需的一个或多个多核苷酸游离存在并包含有包含扰动(例如，一个或多个扰动)的工程化序列。在一些实施方案中，形成病毒载体所必需的一个或多个多核苷酸存在于昆虫细胞的基因组中并包含有包含扰动(例如，一个或多个扰动)的工程化序列。

85、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或病毒载体包含多个独特的扰动。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个独特的扰动。

86、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或病毒载体包含至少一个扰动，所述扰动包括内源性基因组编码序列的插入、缺失、取代、替换、表观遗传修饰和/或重排。在一些实施方案中，内源性编码序列是或包含内源性基因或基因区段。

87、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或病毒载体包含至少一个扰动，所述扰动包括内源性基因组调控元件的插入、缺失、取代、替换、表观遗传修饰和/或重排。在一些实施方案中，内源性调控元件是或包含内源性启动子序列和/或内源性增强子序列。

88、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含至少一个扰动附加序列。在一些实施方案中，扰动附加序列包含rna引导的核酸酶或其衍生物。在一些实施方案中，rna引导的核酸酶包含cas9、cpf1和/或casz或其衍生物，包括包含转录调控因子的融合蛋白(例如，cas9-vpr或cas9-krab-mecp2融合物)、crispr蛋白与核酸酶结构域(例如，fok1)的融合物、酶碱基编辑器(例如，be和abe融合物版本)、逆转录酶融合物(例如，引导编辑器)、crispr重组酶(例如，reccas9)和crispr转座酶(例如，tn7样转座酶系统cas12k和与tniq的级联复合物)。在一些实施方案中，rna引导的核酸酶包含cas9或其衍生物。

89、所提供的文库构建体可以使用本领域已知的任何适当方法引入昆虫细胞。在一些实施方案中，通过转染和/或转导将文库构建体引入昆虫细胞中。在一些实施方案中，通过杆状病毒介导的感染将文库构建体引入昆虫细胞中。在一些实施方案中，通过慢病毒介导的转导将文库构建体引入昆虫细胞中。

90、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体，其中文库构建体的至少一个工程化序列游离存在。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体，其中文库构建体包含至少一个包含至少一个文库变体的工程化序列，并且其中每个单独的细胞包含至少一个扰动附加序列，并且其中至少一个工程化序列游离存在。

91、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体，其中文库构建体的至少一个工程化序列包含至少一个文库变体，并且其中至少一个文库变体游离存在。在一些实施方案中，至少一个文库变体是效应物。在一些实施方案中，至少一个文库变体成为至少一个扰动。在一些实施方案中，至少一个文库变体包含至少一个orf、至少一个基因、至少一个非编码核酸序列和/或至少一个grna，或其多个。

92、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体，其中文库构建体包含至少一个包含至少一个文库变体的工程化序列，所述至少一个文库变体包含至少一个grna，并且其中每个单独的细胞包含至少一个扰动附加序列，所述扰动附加序列包含rna引导的核酸酶或非rna引导的核酸酶或其衍生物，并且其中至少一个工程化序列游离存在。

93、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体，其中文库构建体包含至少一个包含至少一个文库变体的工程化序列，所述至少一个文库变体包含至少一个grna，其中每个单独的细胞包含至少一个扰动附加序列，所述扰动附加序列包含rna引导的核酸酶或非rna引导的核酸酶或其衍生物，并且其中至少一个工程化序列游离存在。

94、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包括至少一个扰动。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个扰动，所述至少一个扰动包括基因组序列变化、游离型序列变化和/或表观遗传修饰。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个扰动，所述至少一个扰动包括内源性基因组编码序列的插入、缺失、取代和/或重排。

95、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生单独地包含至少一个扰动的病毒载体。

96、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体，其中文库构建体的至少一个工程化序列存在于昆虫细胞的基因组中。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞包含文库构建体，其中文库构建体包含至少一个包含至少一个文库变体的工程化序列，并且其中每个单独的细胞包含至少一个扰动附加序列，并且其中至少一个工程化序列存在于昆虫细胞的基因组中。

97、在一些实施方案中，将文库构建体或其一部分在随机插入位点插入昆虫细胞的基因组中。在一些实施方案中，随机插入位点在预定的基因组位置子集中是随机的。在一些实施方案中，将文库构建体或其一部分在预定插入位点插入昆虫细胞的基因组中。

98、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少一个反式作用整合序列，其中所述至少一个反式作用整合序列包含(i)至少一个整合构建体，(ii)至少一个重组酶，和/或其多肽、蛋白质、核酸或多核苷酸产物，(iii)至少一个核酸酶，和/或其多肽、蛋白质、核酸或多核苷酸产物，(iv)至少一个转座酶，和/或其多肽、蛋白质、核酸或多核苷酸产物，和/或(v)至少一个工程化序列。

99、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少一个反式作用整合序列，所述反式作用整合序列包含整合构建体。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少一对位于第一组病毒重复序列侧翼的顺式作用整合序列，其中顺式作用整合序列包含第二组病毒重复序列。在一些实施方案中，整合构建体是昆虫病毒载体或其衍生物。

100、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含第一组病毒重复序列(例如，用于将序列包装到病毒载体靶标中)和包含第二组病毒重复序列的顺式作用整合序列。

101、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少一个反式作用整合序列，所述至少一个反式作用整合序列包含核酸酶和/或其多肽、蛋白质、核酸或多核苷酸产物。

102、在一些实施方案中，至少一个反式作用整合序列包含至少一个核酸酶，并且其中所述至少一个核酸酶包括rna引导的核酸酶或其融合物或衍生物。在一些实施方案中，至少一个反式作用整合序列包含至少一个核酸酶，并且其中所述至少一个核酸酶包括非rna引导的核酸酶或其融合物或衍生物。在一些实施方案中，至少一个核酸酶包括cas9、casz、cpf1、与可编程dna结合结构域(诸如tale蛋白(talen)或锌指蛋白(zfn))融合的工程化fok1核酸酶结构域，和/或大范围核酸酶或其衍生物。在一些实施方案中，至少一个核酸酶包括cas9。

103、在一些实施方案中，至少一个反式作用整合序列还包含至少一个工程化序列。在一些实施方案中，至少一个反式作用整合序列包含rna引导的核酸酶或其融合物或衍生物，并且还包含至少一个grna。

104、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少一对位于第一组病毒重复序列侧翼的顺式作用整合序列，并且其中顺式作用整合序列包含同源臂序列。

105、在一些实施方案中，至少一个反式作用整合序列包含重组酶和/或其多肽、蛋白质、核酸或多核苷酸产物。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少一对位于第一组病毒重复序列侧翼的顺式作用整合序列，并且其中顺式作用整合序列包含重组酶识别位点。在一些实施方案中，重组酶包括cre、flp、dre、phic31和/或bxb1，或其衍生物。

106、在一些实施方案中，重组酶包括包含cre的重组酶。在一些实施方案中，重组酶识别位点包括loxp位点。

107、在一些实施方案中，重组酶包括包含bxb1的重组酶。在一些实施方案中，重组酶识别位点包括att位点。

108、在一些实施方案中，重组酶包括包含flp的重组酶。在一些实施方案中，重组酶识别位点包括frt位点。

109、在一些实施方案中，至少一个反式作用整合序列包含转座酶和/或其多肽、蛋白质、核酸或多核苷酸产物。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含至少一对位于第一组病毒重复序列侧翼的顺式作用整合序列，并且其中顺式作用整合序列包含转座酶识别位点。在一些实施方案中，转座酶包含piggybac转座酶、睡美人转座酶和/或tn5转座酶或其衍生物。在一些特定实施方案中，转座酶包含piggybac转座酶或其衍生物。在一些特定实施方案中，转座酶包含睡美人转座酶或其衍生物。在一些特定实施方案中，转座酶包含tn5转座酶或其衍生物。

110、在一些实施方案中，相对于参考群，昆虫细胞群产生发生改变的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在将核酸转移至细胞的方式上发生改变的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在治疗上发生改变的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在预期应用上发生改变的病毒载体。

111、在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在应用中功能性较低的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在应用中无功能性的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在将核酸转移至细胞方面功能性较低和/或无功能性的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在治疗上功能性较低和/或无功能性的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在预期应用中功能性较低和/或无功能性的病毒载体。

112、在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在应用中功能性较高和/或增强的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在将核酸转移至细胞方面功能性较高和/或增强的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在治疗上功能性较高和/或增强的病毒载体。在一些实施方案中，相对于参考群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群产生在预期应用中功能性较高和/或增强的病毒载体。

113、在一些实施方案中，相对于参考细胞群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个在生产规范下改变病毒载体产生的工程化序列(例如，扰动)。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个在生产规范下提供增加的病毒载体产生的工程化序列(例如，扰动)。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，具有改变的病毒载体产生的昆虫细胞包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个扰动。

114、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个在当时现行的良好生产规范(cgmp)下提供增加的病毒载体产生的工程化序列(例如，扰动)。在一些实施方案中，至少一个工程化序列(例如，扰动)在良好生产规范(gmp)下提供增加的病毒载体产生。在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个在非良好生产规范(non-gmp)下提供增加的病毒载体产生的工程化序列(例如，扰动)。

115、在一些实施方案中，相对于参考细胞群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个提供增加的昆虫细胞群活力的工程化序列(例如，扰动)。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个提供增加的昆虫细胞群产生病毒载体的持续时间的扰动。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个提供增加的昆虫细胞群基因组稳定性的工程化序列(例如，扰动)。

116、在一些实施方案中，相对于参考细胞群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个在生产规范下提供减少的产生的病毒载体百分比的工程化序列(例如，扰动)，所述病毒载体在应用中功能性较低。在一些实施方案中，相比于参考细胞群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个在生产规范下提供减少的产生的病毒载体百分比的扰动，所述病毒载体在应用中无功能性。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，百分比减少的病毒载体在将核酸转移至细胞方面功能性较低和/或无功能性。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，百分比减少的病毒载体在治疗上功能性较低和/或无功能性。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，百分比减少的病毒载体在预期应用中功能性较低和/或无功能性。

117、在一些实施方案中，相对于参考细胞群，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群包含至少一个在生产规范下提供增加的产生的病毒载体百分比的工程化序列(例如，扰动)，所述病毒载体在应用中功能性较高或增强。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，百分比增加的病毒载体在将核酸转移至细胞方面功能性较高和/或增强。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，百分比增加的病毒载体在治疗上功能性较高和/或增强。在一些实施方案中，相对于参考细胞群，百分比增加的病毒载体在预期应用中功能性较高和/或增强。

118、在一些实施方案中，相对于参考细胞群，至少一个工程化序列(例如，扰动)在生产规范下提供增加的病毒载体百分比，所述病毒载体含有用于它们的预期应用的所有和/或必需的核酸序列和/或其他元件。

119、在一些实施方案中，相对于参考细胞群，至少一个工程化序列(例如，扰动)在生产规范下提供减少的病毒载体百分比，所述病毒载体已失去用于它们的预期应用的所有和/或必需的核酸序列和/或其他元件，和/或使其发生突变。

120、在一些实施方案中，提供的昆虫细胞和/或昆虫细胞群和/或病毒载体包含多个工程化序列，其中所述多个工程化序列包含多个扰动。

121、在一些实施方案中，参考细胞群是：(a)不包含所述至少一个工程化序列的可比较的昆虫细胞群；和/或(b)能够产生病毒载体的标准细胞群。

122、在一些实施方案中，相对于参考细胞群，由本文所述的昆虫细胞产生的病毒载体包含在生产规范下改变病毒载体产生的工程化序列(例如，扰动)。在一些实施方案中，病毒载体包含改变功能(例如，治疗功能、将核酸转移至细胞的能力)、基因组稳定性、昆虫细胞的产生产量、昆虫细胞产生持续时间、产生的含有所有必需核酸序列的病毒载体百分比，和/或与病毒载体产生、病毒载体活性和/或病毒载体应用相关的另一个特征的扰动。

123、在一些实施方案中，昆虫细胞群通过以下方式产生：(a)将多个包含多个工程化序列的文库构建体引入到多个昆虫细胞中，其中单独的文库构建体包含至少一个位于第一组两个病毒重复序列之间的标识符，和(b)将至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸引入多个昆虫细胞中。

124、在一些实施方案中，昆虫细胞群通过将多个包含多个工程化序列的文库构建体引入到多个昆虫细胞中产生，其中单独的文库构建体包含至少一个位于第一组两个病毒重复序列之间的标识符，其中多个昆虫细胞包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列。

125、在一些实施方案中，提供了产生病毒载体的方法，其包括：在使得昆虫细胞产生病毒载体的条件下培养本公开的昆虫细胞群，并且其中每个产生的病毒载体包含至少一个源自产生病毒载体的昆虫细胞的至少一个标识符的标识符。在一些实施方案中，每个产生的病毒载体包含至少一个与产生病毒载体的昆虫细胞的至少一个标识符相同的标识符。

126、在一些实施方案中，提供的方法包括：(a)从昆虫细胞文库产生病毒载体，其中昆虫细胞文库包含多个昆虫细胞，其中多个中的每个昆虫细胞单独地包含：(i)至少一个工程化序列，(ii)标识符，和(iii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，并且其中每个病毒载体包含源自产生病毒载体的昆虫细胞的标识符的标识符；以及(b)检测病毒载体中的标识符。在一些实施方案中，每个病毒载体包含与产生病毒载体的昆虫细胞的标识符相同的标识符。

127、在一些实施方案中，提供的方法包括：(a)从昆虫细胞文库产生病毒载体，其中昆虫细胞文库包含多个昆虫细胞，其中多个中的每个昆虫细胞单独地包含：(i)至少一个工程化序列，(ii)至少一个标识符，和(iii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，并且其中每个病毒载体包含至少一个源自产生病毒载体的昆虫细胞的至少一个标识符的标识符；和(b)通过下一代测序检测病毒载体中的一个或多个标识符。在一些实施方案中，每个病毒载体包含至少一个与产生病毒载体的昆虫细胞的至少一个标识符相同的标识符。

128、在一些实施方案中，提供的方法包括：(a)产生aav文库，其中aav文库包含来自昆虫细胞文库的多个aav载体，其中昆虫细胞文库包含多个昆虫细胞，其中多个中的每个昆虫细胞单独地包含：(i)至少一个工程化序列，(ii)至少一个条形码序列，和(iii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中每个aav病毒载体包含至少一个构建体，并且其中至少一个构建体包含源自产生aav病毒载体的昆虫细胞的至少一个条形码序列的条形码序列；和(b)检测aav文库中的一个或多个条形码序列。在一些实施方案中，每个aav病毒载体包含至少一个构建体，并且其中至少一个构建体包含与产生aav病毒载体的昆虫细胞的至少一个条形码序列相同的条形码序列。

129、在一些实施方案中，提供的方法包括：(a)产生aav文库，其中aav文库包含来自昆虫细胞文库的多个构建体，其中昆虫细胞文库包含多个昆虫细胞，其中多个中的每个昆虫细胞单独地包含：(i)至少一个工程化序列，(ii)至少一个条形码序列，和(iii)至少一个包含一个或多个产生病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸，其中每个aav病毒载体包含至少一个构建体，并且其中所述至少一个构建体包含源自产生aav病毒载体的昆虫细胞的至少一个条形码序列的条形码序列；和(b)通过下一代测序检测aav文库中的一个或多个条形码序列。在一些实施方案中，每个aav病毒载体包含至少一个构建体，并且其中至少一个构建体包含与产生aav病毒载体的昆虫细胞的至少一个条形码序列相同的条形码序列。在一些实施方案中，所提供的方法还包括对昆虫细胞文库的每个单独细胞内的至少一个或所有核酸序列或其衍生物进行单细胞测序的步骤，其中至少一个或所有核酸序列或其衍生物在单细胞测序方法过程中包含单细胞身份序列，并且其中至少一个或所有核酸序列或其衍生物包含至少一个文库构建体。

130、在一些实施方案中，本公开提供的方法还包括对昆虫细胞文库的每个单独细胞内的至少一个或所有核酸序列或其衍生物进行单细胞测序，其中至少一个或所有核酸序列或其衍生物在单细胞测序方法过程中包含单细胞身份序列，并且其中至少一个或所有核酸序列或其衍生物包含至少一个包含至少一个标识符的文库变体。

131、在一些实施方案中，本公开提供的方法还包括将第二文库构建体引入昆虫细胞中，其中昆虫细胞包含至少一个源自第一文库构建体的扰动，并且其中第二文库构建体包含至少一个包含位于第一组两个病毒重复序列之间的至少一个标识符的工程化序列。在一些实施方案中，将第二多个文库构建体引入多个昆虫细胞中，其中多个昆虫细胞包含至少一个源自第一多个文库构建体的扰动，并且其中第二多个文库构建体包含多个工程化序列，其中第二多个文库构建体中的每个单独的文库构建体包含至少一个位于第一组两个病毒重复序列之间的标识符。在一些实施方案中，提供的方法还包括通过单细胞测序和/或下一代测序检测一个或多个标识符和/或一个或多个工程化序列。在一些实施方案中，提供的方法包括多于两轮的文库构建体引入和一个或多个标识符和/或一个或多个工程化序列的检测。在一些实施方案中，提供的方法还包括使用机器学习方法来开发机器学习模型以鉴定靶扰动的期望组合。

132、在一些实施方案中，本公开提供的方法还包括去除昆虫细胞的至少一个标识符的步骤。在一些实施方案中，在提供的昆虫细胞和/或文库构建体包含报告基因和/或选择标记的情况下，提供的方法可以包括去除报告基因和/或选择标记的步骤。

133、在整个说明书中，在系统或组合物被描述为具有、包括或包含特定组件的情况下，或者在方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，预期另外存在基本上由所述的组件组成或由所述的组件组成的本发明的系统或组合物，并且存在基本上由所述的步骤组成或由所述的步骤组成的根据本发明的方法。

134、应当理解，步骤的次序或执行某些动作的次序并不重要，只要本发明保持可操作即可。另外，两个或更多个步骤或动作可以同时进行。

135、以下描述仅用于说明和举例说明本公开，并不旨在将本发明限制于所描述的具体实施方案。