1.一种方法,其包括:
2.一种选择用于产生腺相关病毒(aav)载体的昆虫细胞的方法,所述方法包括:
3.如权利要求1或2所述的方法,其中所述一个或多个产生aav载体所必需的序列是在杆状病毒载体的背景下。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法,其还包括确定特定条形码相对于存在于从所述昆虫细胞文库产生的所述多个aav载体中的所有条形码的相对丰度的步骤。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中相对于缺乏所述一个或多个扰动的参考昆虫细胞,所述一个或多个扰动与aav产生和/或aav分泌的增加相关。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法,其中至少一个文库变体被整合到位于一对顺式作用整合序列之间的昆虫细胞基因组中。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述工程化核酸序列的一个或两个拷贝被整合到所述昆虫细胞基因组中。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法,其中至少一个文库变体游离存在于所述昆虫细胞中。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述两个功能性aav itr序列包括人aav1 itr、人aav2 itr、人aav3b itr、人aav4 itr、人aav5 itr、人aav6 itr、人aav7 itr、人aav8 itr、人aav9 itr、人aav10 itr、人aav11 itr、人aav12 itr或人aav13 itr。
10.如权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述两个功能性aav itr序列包括牛aav(b-aav)itr、犬aav(caav)itr、小鼠aav1 itr、山羊aav itr、大鼠aav itr或禽aav(aaav)itr。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述一个或多个产生aav载体所必需的序列包含(a)aav rep基因,(b)aav cap基因,(c)一个或多个aav辅助基因;或(d)其组合。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述一个或多个产生aav载体所必需的序列包含编码人aav1衣壳蛋白、人aav2衣壳蛋白、人aav3b衣壳蛋白、人aav4衣壳蛋白、人aav5衣壳蛋白、人aav6衣壳蛋白、人aav7衣壳蛋白、人aav8衣壳蛋白、人aav9衣壳蛋白、人aav10衣壳蛋白、人aav11衣壳蛋白、人aav12衣壳蛋白,或人aav13衣壳蛋白的aav cap基因。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法,其中所述一个或多个扰动包括内源性基因组编码序列的插入、缺失、取代、替换、表观遗传修饰和/或重排。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法,其中所述一个或多个文库变体包含至少两个文库变体,其中所述至少两个文库变体包含至少一个独特基因、至少一个独特orf、至少一个独特grna序列,和/或至少一个独特非编码核酸,或其组合和/或多个。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法,其中所述方法还包括单细胞测序。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述昆虫细胞文库包括sf21细胞、sf9细胞、bti-tn-5b1-4(high five)细胞、s2细胞、d.mel2细胞或其任意的衍生物。
17.一种包含多个昆虫细胞的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中每个昆虫细胞包含:
18.一种包含多个昆虫细胞的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中每个昆虫细胞包含:
19.如权利要求17或18所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中所述昆虫细胞各自单独地包括sf21细胞、sf9细胞、bti-tn-5b1-4(high five)细胞、s2细胞、d.mel2细胞或其任意的衍生物。
20.如权利要求17至19中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中所述aav载体包含人aav1衣壳蛋白;人aav2衣壳蛋白;人aav3b衣壳蛋白;人aav4衣壳蛋白;人aav5衣壳蛋白;人aav6衣壳蛋白;人aav7衣壳蛋白;人aav8衣壳蛋白;人aav9衣壳蛋白;人aav10衣壳蛋白;人aav11衣壳蛋白;人aav12衣壳蛋白;或人aav13衣壳蛋白。
21.如权利要求17至19中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中所述aav载体包含人祖先aav衣壳蛋白。
22.如权利要求17至21中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中病毒载体包括aav载体,其中所述aav载体包含第一组两个病毒重复序列,所述第一组两个病毒重复序列包含一对反向末端重复序列(itr),其是或包括人aav1 itr;人aav2 itr;人aav3b itr;人aav4itr;人aav5 itr;人aav6 itr;人aav7 itr;人aav8 itr;人aav9 itr;人aav10 itr;人aav11 itr;人aav12 itr;或人aav13 itr。
23.如权利要求17至21中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中所述aav载体包含牛aav(b-aav)衣壳蛋白;犬aav(caav)衣壳蛋白;小鼠aav1衣壳蛋白;山羊aav衣壳蛋白;大鼠aav衣壳蛋白;或禽aav(aaav)衣壳蛋白。
24.如权利要求17至23中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中病毒载体包括aav载体,其中所述aav载体包含一对itr,其是或包括牛aav(b-aav)itr;犬aav(caav)itr;小鼠aav1 itr;山羊aav itr;大鼠aav itr;或禽aav(aaav)itr。
25.如权利要求17至24中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中至少一个包含一个或多个形成病毒载体所必需的核酸序列的多核苷酸包含:
26.如权利要求17至25中任一项所述的昆虫细胞群,其中相对于缺乏所述一个或多个扰动的参考昆虫细胞群,所述一个或多个扰动与aav产生和/或aav分泌的增加相关。
27.如权利要求17至26中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其与缺乏所述一个或多个扰动的昆虫细胞产生的aav群相比产生了包含至少一个改进的特征的aav载体群。
28.如权利要求1至16中任一项所述的方法或如权利要求17至27中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中所述至少一个条形码包含约5至约25个核苷酸的序列。
29.如权利要求1至16中任一项所述的方法或如权利要求17至27中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中所述昆虫细胞各自单独地包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个文库变体。
30.如权利要求1至16中任一项所述的方法或如权利要求17至27中任一项所述的昆虫细胞或昆虫细胞群,其中所述昆虫细胞各自单独地包含多至100个文库变体。