治疗异染性脑白质营养不良的方法与流程

本披露涉及提供用于治疗有需要的患者的异染性脑白质营养不良(mld)的方法，这些方法包括向患者的脑脊液(csf)中施用重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，该病毒颗粒包含编码芳基硫酸酯酶a(arsa)的载体。

背景技术：

1、异染性脑白质营养不良(mld)是一种由芳基硫酸酯酶a(arsa)的突变引起的常染色体隐性神经系统变性病症。arsa活性水平的降低导致硫苷酯的毒性蓄积，其特征为中枢和周围神经系统中髓鞘形成细胞(少突胶质细胞和施万细胞)变性。这会导致脱髓鞘、功能障碍、神经元变性和神经炎症(星形胶质细胞增生、小胶质细胞活化)。临床表现主要在神经系统，进而导致智力残疾、情绪和行为问题、运动技能(移动、说话、吞咽)丧失、肌肉功能差以及瘫痪、失明、听力丧失和癫痫发作。

2、目前治疗mld的方法包括自体造血干细胞移植(hsct)和异基因骨髓移植。

技术实现思路

1、在一些方面，本发明提供了用于治疗有需要的患者的异染性脑白质营养不良(mld)的方法，这些方法包括向患者的脑脊液(csf)中施用重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，该病毒颗粒包含编码芳基硫酸酯酶a(arsa)(本文中也称为arsa多肽)的载体。在一些实施例中，经由脑室内(icv)施用、直接脑池(dcm)施用或鞘内微导管(it-cm)直接将病毒颗粒施用至csf。

2、本发明至少部分地基于raav病毒颗粒的开发，这些raav病毒颗粒包含：(a)raav载体，该载体包含编码芳基硫酸酯酶a(arsa)多肽的表达组件，以及(b)能够转导中枢神经系统(cns)的细胞的衣壳。将病毒颗粒施用至csf中会提供arsa蛋白在脑中的高表达水平。在特定实施例中，病毒颗粒的表达组件能够驱动在中枢和周围神经系统中的转基因表达以治疗mld。在一些实施例中，表达组件包含seq id no:2的arsa基因。在一些实施例中，arsa基因表达具有seq id no:1的arsa多肽。

3、在一些方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒(raav)颗粒，该重组腺相关病毒(raav)颗粒包含raav载体，其中该raav载体包含用于在中枢和周围神经系统中表达arsa多肽的表达组件，其中该表达组件包含与启动子且任选地与增强子可操作地连接的转基因，其中该转基因编码arsa多肽，并且其中该aav病毒颗粒包含能够转导中枢神经系统(cns)的细胞的衣壳蛋白。在一些实施例中，aav衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白(seq id no:9)。在一些实施例中，raav的衣壳是经修饰的aav9衣壳蛋白。在一些实施例中，raav的衣壳是aav.rh10衣壳蛋白。在一些实施例中，arsa基因表达具有seq id no:1的arsa多肽。

4、在一些实施例中，本披露提供了用于csf内施用arsa多肽的raav颗粒，这些raav颗粒包含经修饰的aav9衣壳蛋白，该经修饰的aav9衣壳蛋白包含将raav颗粒靶向脑的靶向肽。这种经修饰的aav9衣壳在国际公开号wo 2021/102234 a1(其特此通过引用以其全文并入)中描述。在特定实施例中，将经修饰的aav9衣壳的靶向肽插入aav9结构蛋白的残基588之后。在一些实施例中，靶向肽具有seq id no:10。在一些实施例中，靶向肽在该靶向肽的n-末端和c-末端侧接接头序列。在一些实施例中，n-端侧上的接头序列具有序列aaa。在一些实施例中，c-端侧上的接头序列是as。在一些实施例中，插入在aav9衣壳结构蛋白的残基588之后的完整序列具有seq id no:11。在一些实施例中，完整的经修饰的aav9衣壳结构蛋白(vp1)具有seq id no:12。具有seq id no:12的衣壳蛋白在本文中被称为aav1999。在一些实施例中，完整的经修饰的aav9衣壳结构蛋白与seq id no:12至少90％(例如，至少92％、至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.5％或至少99.8％)相同，其中经修饰的aav9结构衣壳包含seq id no:10的靶向肽。

5、如本文所披露，包含经修饰的aav9衣壳蛋白的raav颗粒包含三种结构衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。这三种衣壳蛋白是选择性剪接变体。全长vp1蛋白具有seq id no:9的序列。vp2蛋白包含seq id no:9的氨基酸138至736。vp3蛋白包含seq id no:9的氨基酸203至736。在一些实施例中，将靶向肽(seq id no:10)插入至raav颗粒中的aav9 vp3衣壳蛋白中。在一些实施例中，将靶向肽(seq id no:10)插入至raav颗粒中的aav9 vp2衣壳蛋白中。在一些实施例中，将靶向肽(seq id no:10)插入至raav颗粒中的aav9 vp1衣壳蛋白中。在一些实施例中，将靶向肽(seq id no:10)插入至raav颗粒内的vp1、vp2和vp3衣壳蛋白中。在一些实施例中，经修饰的aav9衣壳蛋白中的靶向肽在该靶向肽的n-末端和c-末端侧接接头序列。在一些实施例中，n-端侧上的接头序列具有序列aaa。在一些实施例中，c-端侧上的接头序列是as。

6、已发现，包含经修饰的aav9衣壳蛋白(其包含seq id no:10的靶向肽)的raav颗粒在施用至受试者的脑(例如，csf内施用)后显示出非常高的转基因表达水平。例如，在csf内施用raav颗粒之后，包含具有seq id no:12的经修饰的vp1衣壳蛋白(和/或具有seq idno:13的经修饰的vp2衣壳蛋白和/或具有seq id no:14的经修饰的vp2衣壳蛋白)的raav颗粒在脑和脊髓中的转基因表达水平高于包含能够转导cns的细胞的其他衣壳(例如，aav9和aav.rh10)的raav颗粒。相反，在csf内施用包含经修饰的aav9衣壳(其包含seq id no:10的靶向肽)的raav颗粒之后，在例如心脏和肝脏等其他器官中表达的转基因水平显著降低。此外，相对于包含能够转导cns的细胞的其他衣壳(例如，aav9和aav.rh10)的raav颗粒，较低剂量的包含经修饰的aav9衣壳(其包含seq id no:10的靶向肽)的raav颗粒便可实现高的表达水平。因此，相对于包含aav9衣壳或aav.rh10衣壳的raav颗粒，包含经修饰的aav9衣壳蛋白(其包含seq id no:10的靶向肽)的raav颗粒具有改善的治疗指数。

7、因此，在一个方面，本发明提供了用于治疗有需要的患者的mld的方法，这些方法包括向患者的脑脊液(csf)中施用重组腺相关病毒(raav)病毒颗粒，该病毒颗粒包含(1)编码arsa多肽的载体以及(2)经修饰的aav9衣壳蛋白，其中该经修饰的raav衣壳蛋白包含seqid no:10的靶向肽。在一些实施例中，包含seq id no:10的经修饰的aav9衣壳蛋白与具有seq id no:12的衣壳蛋白至少90％(例如，至少92％、至少95％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.2％、至少99.5％或至少99.8％)相同。在一些实施例中，衣壳蛋白具有seqid no:12。

8、在上述方面的一些实施例中，raav颗粒包含载体，该载体包含侧接一个或多个aav反向末端重复(itr)序列的表达组件。在一些实施例中，该表达组件侧接两个aav itr。在一些实施例中，这些aav itr是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aav.rh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav血清型itr。在一些实施例中，这些aav itr是aav2 itr。在一些实施例中，载体是自身互补的载体。在一些实施例中，载体包含编码arsa多肽的第一核酸序列和编码该arsa多肽的互补序列的第二核酸序列，其中第一核酸序列可沿其大部分或全部长度与第二核酸序列形成链内碱基对。在一些实施例中，第一核酸序列与第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中突变的aav itr包含d区的缺失且包含末端解析序列(terminal resolutionsequence)的突变。

9、在一些方面，本发明提供了包含本文所述的任何raav颗粒的组合物。在一些实施例中，该组合物进一步包含药学上可接受的载剂。

10、在一些方面，本发明提供了一种包含本文所述的任何raav颗粒的细胞。在一些方面，本发明提供了一种生产arsa多肽的方法，该方法包括在生产arsa多肽的条件下培养如本文所述的细胞。在一些实施例中，这些方法进一步包含对arsa多肽进行纯化的步骤。

11、在一些方面，本发明提供了用于治疗有需要的个体的mld的方法，这些方法包括向该个体施用如本文所述的raav颗粒。在一些方面，本发明提供了用于治疗有需要的个体的mld的方法，这些方法包括向该个体施用如本文所述的组合物。在一些实施例中，本发明提供了用于治疗有需要的个体的mld的方法，这些方法包括向该个体施用如本文所述的细胞。在一些实施例中，该个体缺乏arsa活性。

12、在一些实施例中，本发明提供了在有需要的个体中将arsa活性增加至少约5％的方法，这些方法包括向该个体施用如本文所述的raav颗粒。在其他实施例中，本发明提供了在有需要的个体中将arsa活性增加至少约10％的方法，这些方法包括向该个体施用如本文所述的raav颗粒。在其他实施例中，本发明提供了在有需要的个体中将arsa活性增加至少约20％的方法，这些方法包括向该个体施用如本文所述的raav颗粒。在其他实施例中，本发明提供了在有需要的个体中将arsa活性增加至少约30％的方法，这些方法包括向该个体施用如本文所述的raav颗粒。在其他实施例中，本发明提供了在有需要的个体中将arsa活性增加至少约50％的方法，这些方法包括向该个体施用如本文所述的raav颗粒。

13、raav颗粒的施用可通过各种途径进行。在一些实施例中，该施用包括直接脊髓注射和/或脑内施用。在一些实施例中，该施用在选自以下的部位进行：大脑、髓质、脑桥、小脑、颅内腔、脑周围脑膜、硬脑膜、蛛网膜、软膜、脑周围蛛网膜下腔的脑脊液(csf)、小脑深部核(deep cerebellar nuclei of the cerebellum)、大脑脑室系统(ventricularsystem of the cerebrum)、蛛网膜下腔、纹状体、皮质、隔膜、丘脑、下丘脑和脑实质。在一些实施例中，该施用包括脑室内注射至至少一个脑侧脑室中。在一些实施例中，该施用包括在颈部、胸部和/或腰部区中进行鞘内注射。在一些实施例中，该施用包括纹状体内注射。在一些实施例中，该施用包括丘脑内注射。

14、在上述方面的一些实施例中，raav颗粒经由直接注射至脊髓中、通过鞘内注射和/或通过脑池内注射施用。在一些实施例中，raav颗粒被施用至脊髓或脑池的超过一个位置。在一些实施例中，raav颗粒被施用至脊髓的超过一个位置。在一些实施例中，raav颗粒被施用至脊髓的腰蛛网膜下腔、胸蛛网膜下腔和颈蛛网膜下腔中的一个或多个。在一些实施例中，raav颗粒被施用至脑池。

15、在上述方面的一些实施例中，仅向有需要的患者施用一次raav颗粒。在一些实施例中，向有需要的患者施用多次raav颗粒(例如，在一个月或多个月或几年内)。在其他实施例中，向有需要的患者每年施用一次raav颗粒。在其他实施例中，向有需要的患者每年施用两次raav颗粒。

16、在一些实施例中，本发明提供了包含如本文所述的raav颗粒、组合物或细胞中的任一种的试剂盒。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含使用说明书；缓冲液和/或药学上可接受的赋形剂；和/或瓶子、小瓶和/或注射器。