一种直扩型DNA聚合酶和直扩型PCR检测试剂盒的制作方法

本技术涉及生物技术和酶工程，特别是涉及一种直扩型dna聚合酶和直扩型pcr检测试剂盒。

背景技术：

1、直扩技术(direct pcr)，也称为直接扩增技术或免提取扩增技术，即不需核酸提取和纯化步骤，直接针对适量生物样本进行pcr扩增操作，并获得扩增产物。直扩技术具有简化检测步骤、提高检测效率、降低检测成本等的优点。目前，鼠尾、植物等样本的直接扩增已有商品化的pcr试剂。而随着技木的不断发展，基于实时荧光定量的第二代pcr技术(荧光定量pcr)的应用越来越广泛，因而直扩技术应用于荧光定量pcr领域也具有越来越多的需求。但是，生物样本通常包含各种干扰扩增的物质，例如细胞中所包含蛋白等杂质，此外，基因组dna样本大多来自于血液，而血液样本对于荧光的采集有很强的抑制作用，使荧光定量pcr无法准确定量，影响检验的结果。因此，直接扩增试剂在灵敏性和抗干扰性上还需要改善。

2、叶酸是一种水溶性b族维生素，人体自身不能合成，必须从外界摄入。孕妇对叶酸的需求量比正常人高4倍，适当补充叶酸能够有效地降低胎儿畸形发生的概率。科学研究发现，叶酸利用能力受遗传因素影响，人与人之间因基因不同，对叶酸的代谢吸收能力也不同。通过进行基因检测，能够有利于了解自身的叶酸代谢能力，实现个体化补充叶酸，降低相关疾病的发病风险。其中，四氢叶酸还原酶(mthfr)的c677t位点的基因多态性会影响叶酸的代谢能力。但目前针对mthfr 677ct分型的直扩型荧光定量pcr检测中，检测效果不够理想，尤其是ct杂合型样本，存在荧光增量低，易被误判等问题。

3、综上所述，亟需提供一种对生物样本进行直扩型荧光定量pcr检测且检测效果较好的试剂。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一种直扩型dna聚合酶和直扩型pcr检测试剂盒。

2、本技术采用了以下技术方案：

3、本技术的第一方面公开了一种直扩型dna聚合酶，所述直扩型dna聚合酶为pfudna聚合酶至少经过以下氨基酸突变而获得：n210d、f216s、s334r、e622q、i703l和g707e。

4、需要说明的是，本技术的直扩型dna聚合酶，通过n210d、f216s、s334r的氨基酸突变，能够提高改造后的pfu聚合酶在全血样本中核酸外切酶活性，通过e622q、i703l和g707e的氨基酸突变，能够提高改造后的pfu聚合酶在全血样本中的催化活性。由此，能够提高对血红素、血红蛋白等干扰物的抗干扰能力，进而提高对生物样本直接进行荧光定量pcr检测的准确性。

5、本技术的一种实现方式中，所述直扩型dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。由此，能够提供一种有利于提高对生物样本直接进行荧光定量pcr检测的准确性的dna聚合酶。

6、本技术的第二方面公开了一种编码本技术第一方面所述的直扩型dna聚合酶的核苷酸序列。需要说明的是，可以理解地，本技术同样公开一种编码本技术第一方面所述的直扩型dna聚合酶的氨基酸序列，该氨基酸序列与本技术第二方面公开的核苷酸序列相对应。

7、本技术的一种实现方式中，所述核苷酸序列如seq id no.2所示。需要说明的是，seq id no.2所示的核苷酸序列是按照大肠杆菌的密码子偏好进行设计得到的，由此能够有利于利用大肠杆菌表达和生产本技术的直扩型dna聚合酶。

8、本技术的第三方面公开了一种重组质粒，所述重组质粒含有如本技术第二方面公开的核苷酸序列。

9、本技术的第四方面公开了一种重组细胞(或重组工程菌)，所述重组细胞表达如本技术第二方面公开的核苷酸序列或如本技术第三方面公开的重组质粒。

10、本技术的第五方面公开了一种直扩型pcr检测试剂盒，包括本技术第一方面所述的直扩型dna聚合酶。

11、本技术的第五方面公开了一种直扩型pcr检测mthfr 677ct分型的试剂盒，包括本技术第一方面所述的直扩型dna聚合酶，以及针对mthfr基因677ct设计的特异性引物和特异性探针。

12、本技术的一种实现方式中，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如seq id no.3所示，所述反向引物的序列如seq id no.4所示，seq id no.3：5’-ctgaagcacttcaaggagaa-3’，seq id no.4：5’-aaagaaaagctgcgtgatga-3’。需要说明的是，本技术中，针对mthfr 677位点，按照严格的引物设计原则进行设计引物，并通过大量的研究和测试，对引物序列进行优化，得到了如上所述的引物序列，能够有利于提高对mthfr677位点检测的准确性。

13、本技术的一种实现方式中，所述特异性探针包括第一探针和第二探针，所述第一探针如seq id no.5所示，所述第二探针如seq id no.6所示；seq id no.5：5’-aaattcggctccc-3’，seq id no.6：5’-aaattcgactcccg-3’，所述第一探针和第二探针的5’端和3’端分别标记有荧光基团和荧光淬灭基团，并且，第一探针和第二探针标记的荧光基团不同。

14、本技术的一种实现方式中，seq id no.5所示序列的第一探针中，自5’端起第1、3、4和10位碱基为锁核酸。

15、本技术的一种实现方式中，seq id no.6所示序列的第二探针中，自5’端起第1、2、3、4、5、10和11位碱基为锁核酸。

16、需要说明的是，本技术中，为了降低非特异扩增和提高直扩时探针与模板的结合效率，在探针中使用了锁核酸，并通过大量的研究和测试，得到了如上所述的具体的探针，能够有利于提高通过荧光定量pcr对mthfr 677位点进行直扩检测的准确性。

17、本技术的一种实现方式中，所述第一探针和第二探针标记的荧光基团不重复地选自fam、vic、tet、hex和rox。

18、本技术的一种实现方式中，所述第一探针和第二探针标记的荧光淬灭基团为mgb。

19、本技术的一种实现方式中，还包括pcr缓冲液，所述pcr缓冲液包括：10mm至50mm的tris缓冲液、10mm至250mm的氯化钾、1mm至10mm的氯化镁、0.1m至1.5m的甜菜碱、质量分数(g/ml)为1％至10％的聚乙二醇、200μm至400μm的dntps、以及体积分数为0.1％至2％的吐温-20需要说明的是，通过本技术的pcr缓冲液，能够有利于保护pcr反应体系中的pfu聚合酶，并能够有利于提高检测的荧光值，进而，能够有利于提高通过荧光定量pcr进行直扩的检测准确性。

20、本技术的一种实现方式中，40mm的tris缓冲液、150mm的氯化钾、5mm的氯化镁、0.5m的甜菜碱、质量分数为3％的聚乙二醇、300μm的dntps、以及体积分数为1％的吐温-20。由此，能够进一步提高通过荧光定量pcr进行直扩的检测准确性。

21、本技术的一种实现方式中，所述试剂盒还包括增强剂和去离子水，所述增强剂为300μg/ml的bsa(牛血清白蛋白)和0.3％的brij35(月桂醇聚氧乙烯醚)。增强剂能够减少血红蛋白和血红素等对聚合酶的影响。

22、本技术的有益效果在于：

23、本技术的直扩型dna聚合酶，对于生物样本中的干扰物具有较好的抗干扰能力，能够有利于提高对生物样本直接进行荧光定量pcr检测的准确性。