一种超多重PCR引物组和检测广谱猪病原的超多重PCR和纳米孔测序方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种超多重pcr引物组和检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法。

背景技术：

1、养殖行业规模化已经在近些年达到顶峰，从2004年统计至今，各种疫病，如：非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、仔猪腹泻病、伪狂犬病、口蹄疫、圆环二型等疾病，对养猪行业产生了巨大的冲击，需要更为便携、快速、精准、普及的检测手段。在规模化的养猪场，现阶段国家要求必须配备检测实验室，这项措施也能有效提高猪场效益，同时能更及时地做好生物安全防控。而在多种检测技术中，实时荧光定量pcr技术脱颖而出，真正做到了普及化，同时具备着操作简便、高敏感、高特异性、成本低廉等优点，俨然已经成为行业的检测金标准。但最近几年，随着病原的不断变异或者说进化、猪场规模的不断扩大、检测样本数量的爆发式增长，传统的pcr包括一些基于qpcr的其他方法如数字pcr、多重荧光定量pcr等，都已经无法满足现在检测大环境的需求。在pcr自1985年作为一种专利所属的生物技术登上生物学的舞台之前，一代测序技术就已经于1977年问世。随着时间的推进，测序领域的发展至今还未停止，包括现在已经极为成熟的二代测序和正受到广泛关注的三代测序，三代纳米孔测序甚至被称为″未来的唯一答案″。

2、目前，基于电信号检测的纳米孔测序技术是目前实验操作最简单、测序速度最快的高通量测序平台，但是目前采用的测序方法想要快速检测大量样本以及多种病原时依旧存在错误率较高、检测效率低等问题。

3、如果能够提供一种超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序的广谱猪病原检测方法，可以快速检测大量样本及筛查样本中的大部分猪病原。对大规模养殖的常态检测以及疫情发生时的紧急防控有重大意义。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、作为本发明其中一个方面，本发明提供一种超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序的广谱猪病原检测方法，其包括45重荧光定量pcr扩增：使用45种特异性特异性引物及探针对待测样本进行超多重pcr扩增，检测45种猪病原，所述特异性特异性引物及探针的序列如seq id no：1～135所示。

3、作为本发明所述的检测广谱猪病原的超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序方法的优选方案：所述45种猪病原分别为：口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemicdiarrhea virus)、日本脑炎病毒(japanese encephalitis virus)、猪蓝耳病病毒欧洲型(porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2)、猪蓝耳病病毒美洲型(porcine reproductive and respiratory syndrome virus 1)、猪瘟病毒(classicalswine fever virus)、猪细小病毒(porcine parvovirus)、猪轮状病毒(rotavirus)、猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus)、猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)、圆环病毒i型(porcine circovirus 1)、圆环病毒ii型(porcine circovirus 2)、猪链球菌(streptococcus suis)、猪肺炎支原体(mycoplasma hyopneumoniae)、猪丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、支气管败血波氏杆菌(bordetella bronchiseptica)、胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae)、副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis)、多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)、胞内劳森菌(lawsoniaintracellularis)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens type)、艰难梭菌(clostridium difficile)、猪水疱病病毒(swine vesicular disease)、尼帕病毒(nipahvirus)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus)、猪流感病毒(swine influenza virus)、圆环病毒iii型(porcine circovirus 3)、牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea virus)、猪布鲁氏菌(brucella suis)、猪鼻支原体(mycoplasmahyorhinis)、附红细胞体(eperythrozoon)、沙门氏菌(salmonella)、塞内卡病毒(senecavalley virus)、猪滑液支原体(mycoplasma hyosynoviae)、衣原体(chlamydia porcine)、猪细菌性痢疾(swine dysentery)、钩端螺旋体(leptospira species)、旋毛虫(trichinella)、隐孢子虫(cryptosporidium)、弓形虫(toxoplasma gondii)、猪等胞球虫(isospora suis)、猪蛔虫(ascaris lumbricoides)、疥螨(sarcoptes scabiei)、囊尾蚴(cysticerci)。

4、作为本发明所述的检测广谱猪病原的超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序方法的优选方案：所述检测广谱猪病原的超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序方法由以下步骤组成，

5、(1)样本的采集及样本核酸提取；

6、(2)权利要求1所述的45重荧光定量pcr扩增；

7、(3)构建纳米孔测序文库；

8、(4)上机测序及生物信息学分析。

9、作为本发明所述的检测广谱猪病原的超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序方法的优选方案：步骤(1)中，所述样本包括猪鼻咽拭子、口腔液、血液、血拭子、各类猪组织样本、环境取样样本中的一种或几种。

10、作为本发明所述的检测广谱猪病原的超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序方法的优选方案：所述pcr扩增的反应体系为：4×capital qpcr probe master mix 10ul，20×rtase with rnase lnhibitor 1ul，500nmol/l引物5ul，50nmol/l探针3ul，加去离子水1ul，样本核酸5ul。

11、作为本发明所述的检测广谱猪病原的超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序方法的优选方案：pcr扩增的反应程序为：反转录50℃10min，预变性95℃3min，变性95℃10s，延伸65℃3min，反应循环数40，所有探针均为fam通道。

12、作为本发明所述的检测广谱猪病原的超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序方法的优选方案：所述构建纳米孔测序文库，包括按照连接试剂盒构建纳米孔测序文库，包括pcr产物纯化、pcr产物末端修复、标签连接、接头连接。

13、作为本发明所述的检测广谱猪病原的超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序方法的优选方案：步骤(4)中，所述全基因组测序包括准备测序芯片，进行质检，之后将纳米孔测序芯片装入测序仪上进行纳米孔测序。

14、本发明的有益效果：本发明提供一种超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序的广谱猪病原检测方法，能够快速检测大量样本及筛查样本中的大部分猪病。本发明能够在一个反应孔中同时检测96个样本及每个样本中的45种猪病原，本发明方法对大规模养殖的常态检测以及疫情发生时的紧急防控有重大意义。