1.一种超多重pcr引物组,其特征在于:所述超多重pcr引物组由45对特异性引物及探针组成,所述45对特异性引物及探针的序列如seq id no:1~135所示。
2.一种检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法,其特征在于:包括45重荧光定量pcr扩增:使用45种特异性特异性引物及探针对待测样本进行超多重pcr扩增,检测45种猪病毒抗原,所述特异性特异性引物及探针的序列如seq id no:1~135所示。
3.根据权利要求2所述的检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法,其特征在于:所述45种猪病原分别为:口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus)、日本脑炎病毒(japanese encephalitis virus)、猪蓝耳病病毒欧洲型(porcinereproductive and respiratory syndrome virus 2)、猪蓝耳病病毒美洲型(porcinereproductive and respiratory syndrome virus 1)、猪瘟病毒(classical swine fevervirus)、猪细小病毒(porcine parvovirus)、猪轮状病毒(rotavirus)、猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus)、猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)、圆环病毒i型(porcine circovirus 1)、圆环病毒ii型(porcine circovirus 2)、猪链球菌(streptococcus suis)、猪肺炎支原体(mycoplasma hyopneumoniae)、猪丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、支气管败血波氏杆菌(bordetella bronchiseptica)、胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae)、副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis)、多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)、胞内劳森菌(lawsoniaintracellularis)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens type)、艰难梭菌(clostridium difficile)、猪水疱病病毒(swine vesicular disease)、尼帕病毒(nipahvirus)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus)、猪流感病毒(swine influenza virus)、圆环病毒iii型(porcine circovirus 3)、牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea virus)、猪布鲁氏菌(brucella suis)、猪鼻支原体(mycoplasmahyorhinis)、附红细胞体(eperythrozoon)、沙门氏菌(salmonella)、塞内卡病毒(senecavalley virus)、猪滑液支原体(mycoplasma hyosynoviae)、衣原体(chlamydia porcine)、猪细菌性痢疾(swine dysentery)、钩端螺旋体(leptospira species)、旋毛虫(trichinella)、隐孢子虫(cryptosporidium)、弓形虫(toxoplasma gondii)、猪等胞球虫(lsospora suis)、猪蛔虫(ascaris lumbricoides)、疥螨(sarcoptes scabiei)、囊尾蚴(cysticerci)。
4.根据权利要求1或2所述的检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法,其特征在于:所述检测广谱猪病原的超多重pcr引物组和纳米孔单分子测序方法由以下步骤组成,
5.根据权利要求4所述的检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法,其特征在于:步骤(1)中,所述样本包括猪鼻咽拭子、口腔液、血液、血拭子、各类猪组织样本、环境取样样本中的一种或几种。
6.根据权利要求4或5检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法,其特征在于:所述pcr扩增的反应体系为:4×capital qpcr probe master mix 10ul,20×rtase withrnase inhibitor 1ul,500nmol/l引物5ul,50nmol/l探针3ul,加去离子水1ul,样本核酸5ul。
7.根据权利要求4或5所述的检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法,其特征在于:pcr扩增的反应程序为:反转录50℃ 10min,预变性95℃ 3min,变性95℃ 10s,延伸65℃ 3min,反应循环数40,所有探针均为fam通道。
8.根据权利要求4或5所述的检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法,其特征在于:所述构建纳米孔测序文库,包括按照连接试剂盒构建纳米孔测序文库,包括pcr产物纯化、pcr产物末端修复、标签连接、接头连接。
9.根据权利要求4或5所述的检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法,其特征在于:步骤(4)中,所述全基因组测序包括准备测序芯片,进行质检,之后将纳米孔测序芯片装入测序仪上进行纳米孔测序。
10.根据权利要求4或5所述的检测广谱猪病原的超多重pcr和纳米孔测序方法,其特征在于:步骤(4)中,所述生物信息学分析,包括,将在测序过程中使用guppy将光信息转化为fastq并进行barcode拆分的测序数据,远程传输到分析平台;然后,将不同样本的fastq文件进行合并;使用nanostat对各样本的测序数据进行质量监测;使用minimap2将对各样本reads与猪全基因组序列比对;根据比对信息使用samtools进行非宿主序列提取,以获取去除宿主后的序列;将去除宿主后的fastq序列用seqtk转化为fasta序列;使用blastn将对各样本reads与自建参考数据库比对并进行覆盖度80%,相似度80%过滤;每条序列比对结果保留第一条;给比对结果文件添加表头;根据比对上的subject信息添加物种信息;使用自写脚本对分析结果中各物种进行序列数统计,通过生信数据分析,样品中微生物reads数与阳性质控barcode相比大于十倍,即判定为该种微生物阳性。