一种VCAM-1单克隆抗体、制备方法及检测试剂盒和应用与流程

本技术属于单克隆抗体，具体涉及一种vcam-1单克隆抗体、制备方法及检测试剂盒和应用。

背景技术：

1、冠状动脉粥样硬化型心脏病(coronary heart disease，chd)是世界上发病率和病死率最高的疾病之一，严重影响着人类的寿命和生存质量。国内外许多权威文献都把冠心病看作是一种多风险因素(易感基因与环境因素)共同作用的疾病，其主要病因是冠状动脉血管富脂粥样硬化斑块的形成。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，是冠心病的发病基础，慢性炎症促进了冠心病的进展。炎性细胞(单核/巨噬细胞，中性粒细胞及t淋巴细胞等)释放大量的炎性介质，如il-1、tnf-a、ifn-a以及ang ii等，激活核因子-kb(nf-kb)后，使血管内皮细胞分泌细胞粘附分子，如血管细胞间粘附分子-1(vcam-1；又名cd106)等，它们促进循环中单核细胞、中性粒细胞、t淋巴细胞及血小板黏附于血管内皮，通过释放蛋白酶及氧自由基直接损伤血管内皮细胞，引起炎症反应、血栓形成，在chd的发生、发展中起重要作用。可溶性血管细胞粘附分子(soluble vcam-1，svcam-1)是血管细胞粘附分子的可溶形式，在冠状动脉粥样硬化的过程中的作用尤为显著。

2、粘附分子(adhesion molecules,am)是一类分布于细胞表面或细胞外基质中的糖蛋白。它们以配体-受体相对应的形式发挥作用，介导细胞-细胞、细胞-细胞外基质或细胞-基质-细胞间发生黏附。粘附分子根据cdna同源性，目前主要分为五大类，包括：免疫球蛋白超家族、选择素家族、整合素家族、黏蛋白样家族、钙黏素家族。此外还有些尚未归类的分子如cd44、cd36等，也属于粘附分子。

3、人血管细胞粘附分子-1(vcam-1)主要表达于血管内皮细胞，亦可表达于其他细胞如巨噬细胞、肌细胞、树突状细胞。vcam-1在正常血管上的表达用标准的免疫组织化学方法检测不到，而在炎症等病理条件下，血管内皮细胞、平滑肌细胞、骨髓基质细胞等的表达明显上升。单核细胞和内皮细胞的粘附，以及相伴随的细胞因子的释放导致血管内皮细胞上表达的粘附分子vcam-1释放而成为svcam-1。svcam-1只有在病变形成伊始，或是出现血管痉挛、斑块不稳定等炎症急剧变化时迅速而明显增加，而且其上升的幅度与局部炎症的严重情况明显相关，在局部病变消退至相对比较平稳的时候，血中检测不到svcam-1的升高。svcam-1在正常个体中无明显的差异性，但在已确诊为冠心病的患者，排除其他因素后，稳定型心绞痛患者svcam-1水平与正常对照组无明显差别，也不能反应冠状动脉病变(由冠状动脉造影判断)的严重性。对于svcam-1与急性冠状动脉综合征的关系，不稳定型心绞痛和非q波心肌梗死患者svcam-1明显高于稳定型心绞痛患者，且维持达6月之久，6个月后至1年内逐渐下降至接近正常人水平；且svcam-1的升高与发病6个月后再发生心血管恶性事件明显相关，svcam-1可以很好的预测将来发生严重心血管事件的危险性，提供针对vcam-1的单克隆抗体，对冠心病患者未来致命性心血管事件的检测具有重要意义。

技术实现思路

1、为了检测人血管细胞粘附分子-1(vcam-1)，本技术的目的旨在提供一种抗人血管细胞粘附分子-1的单克隆抗体，作为vcam-1的检测试剂，对vcam-1进行高特异性、高灵敏度、高准确性检测。

2、在本技术的第一方面，提供了一种vcam-1单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区vh和轻链可变区vl。

3、所述重链可变区vh为具有互补决定区cdr1h、cdr2h和cdr3h的片段，其中，所述互补决定区cdr1h的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述互补决定区cdr2h的氨基酸序列如seqid no.2所示；所述互补决定区cdr3h的氨基酸序列如seq id no.3所示；

4、所述轻链可变区vl为具有互补决定区cdr1l、cdr2l和cdr3l的片段，其中，所述互补决定区cdr1l的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述互补决定区cdr2l的氨基酸序列如seqid no.5所示；所述互补决定区cdr3l的氨基酸序列如seq id no.6所示。

5、在本技术的一个实施方案中，所述重链可变区vh为具有互补决定区cdr1h、cdr2h和cdr3h的片段，其中，所述互补决定区cdr1h的dna序列如seq id no.7所示；所述互补决定区cdr2h的dna序列如seq id no.8所示；所述互补决定区cdr3h的dna序列如seq id no.9所示；

6、在本技术的一个实施方案中，所述轻链可变区vl为具有互补决定区cdr1l、cdr2l和cdr3l的片段，其中，所述互补决定区cdr1l的dna序列如seq id no.10所示；所述互补决定区cdr2l的dna序列如seq id no.11所示；所述互补决定区cdr3l的dna序列如seq id no.12所示。

7、在本技术的一个实施方案中，所述重链可变区vh包含框架区frh。

8、优选的，所述框架区frh包括框架区fr1h、fr2h、fr3h和fr4h，所述框架区fr1h、fr2h、fr3h和fr4h的氨基酸序列如seq id no.13～16所示。

9、优选的，所述框架区frh包括框架区fr1h、fr2h、fr3h和fr4h，所述框架区fr1h、fr2h、fr3h和fr4h的dna序列如seq id no.17～20所示。

10、更优选的，所述重链可变区vh的氨基酸序列如seq id no.21所示；所述重链可变区vh的dna序列如seq id no.22所示。

11、在本技术的一个实施方案中，所述轻链可变区vl包含框架区frl。

12、优选的，所述框架区frl包括框架区fr1l、fr2l、fr3l和fr4l，所述框架区fr1l、fr2l、fr3l和fr4l的氨基酸序列如seq id no.23～26所示。

13、优选的，所述框架区frl包括框架区fr1l、fr2l、fr3l和fr4l，所述框架区fr1l、fr2l、fr3l和fr4l的dna序列如seq id no.27～30所示。

14、更优选的，所述轻链可变区vl的氨基酸序列如seq id no.31所示；所述轻链可变区vl的dna序列如seq id no.32所示。

15、在本技术的一个实施方案中，所述单克隆抗体包含氨基酸序列如seq id no.33所示的重链和氨基酸序列如seq id no.34所示的轻链。

16、在本技术的一个实施方案中，所述单克隆抗体包含dna序列如seq id no.35所示的重链和dna序列如seq id no.36所示的轻链。

17、在本技术的第二方面，提供了上述所述vcam-1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

18、(a)制备重组人vcam-1蛋白：

19、以t载体连接试剂盒进行连接，添加引物、cdna模板开始反应，构建原核表达质粒pet-28-vcam-1，然后使用构建的pet-28-vcam-1转化bl21(de3)感受态细胞，在上述细胞内进行重组人vcam-1蛋白的转录、翻译和收集；

20、(b)制备单克隆抗体：

21、采用重组人vcam-1蛋白对小鼠进行免疫，将经过免疫的小鼠脾脏制备成脾淋巴细胞悬液，与骨髓瘤细胞进行细胞融合并培养，即得杂交瘤细胞；对分泌抗性呈阳性的杂交瘤细胞进行克隆得到单克隆细胞，定株扩大培养并进行细胞冻存，即得单克隆抗体。

22、在本技术的第三方面，提供了一种包含有上述所述vcam-1单克隆抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：包被人vcam-1抗原蛋白的微孔板、含有所述vcam-1单克隆抗体的酶标记抗体、样本稀释液、双组分化学发光液、酶工作液。

23、在本技术的一个实施方案中，所述含有所述vcam-1单克隆抗体的酶标记抗体最终工作浓度为1mg/ml。

24、在本技术的第四方面，提供了一种重组质粒，所述重组质粒包含上述所述互补决定区cdr1h、cdr2h和cdr3h的片段，以及所述cdr1l、cdr2l和cdr3l的片段。

25、在本技术的一个实施方案中，所述重组质粒包含氨基酸序列如seq id no.19所示的所述重链可变区vh和氨基酸序列如seq id no.27所示的轻链可变区vl。

26、优选的，所述重组质粒包含氨基酸序列如seq id no.29所示的重链和氨基酸序列如seq id no.30所示的轻链。

27、在本技术的一个实施方案中，所述重组质粒包含dna序列如seq id no.20所示的所述重链可变区vh的和dna序列如seq id no.28所示的所述轻链可变区vl。

28、优选的，所述重组质粒包含dna序列如seq id no.31所示的重链和dna序列如seqid no.32所示的轻链。

29、在本技术的第五方面，提供了所述单克隆抗体或所述重组质粒在制备vcam-1蛋白检测产品中的应用。

30、综上所述，本技术具有以下有益效果：

31、1、本技术中的包含vcam-1单克隆抗体的试剂盒稳定性良好，回收率达标、系统线性和重复性好。

32、2、本技术中的包含vcam-1单克隆抗体的试剂盒，在有较高的同源性、序列相似或者具有相似检测意义的蛋白存在时，具有优良的抗交叉反应性；对于人vcam-1蛋白检测结果有较好的阳阴性符合率，检测结果可以用于较准确的反映受试者是否患有急性冠脉综合征。

33、说明书附图

34、图1是本技术实施例人血管细胞粘附分子-1蛋白的电泳图；

35、图2是本技术实施例pet-28a-vcam-1质粒dna的电泳图；

36、图3是本技术实施例pet-28-vcam-1重组抗原的电泳图。