一种多囊卵巢综合征动物模型的构建方法及其应用

本发明涉及疾病模型构建，特别涉及一种多囊卵巢综合征动物模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、多聚胞嘧啶结合蛋白(poly(c)-binding proteins，pcbp)是一类广泛表达的rna结合蛋白家族，它们对poly(c)序列具有高亲和力，能与其发生特异性结合从而相互作用。在哺乳动物中，pcbp蛋白家族主要包括两个亚群：pcbp(pcbp1，pcbp2，pcbp3，pcbp4)和异质核糖核蛋白(hnrnp)k，该家族蛋白均含有3个长度约为70个氨基酸的hnrnp k同源(kh)结构域，可与poly(c)序列结合来执行多种功能，也可在细胞内进行转录和转录后调控，包括mrna选择性剪切、调节mrna稳定性、以及翻译调控等，且已被证明在多种疾病中发挥作用。

2、斑马鱼(danio rerio)是一种小型热带淡水鱼，目前被认为是脊椎动物发育研究中的重要模式生物之一，已被广泛运用于胚胎发育、组织再生、神经系统发育、免疫应答、药物筛选和疾病模型等领域，在生物医学研究方面发挥着重要作用。斑马鱼具有体型小、繁殖快、体外胚胎发育、胚体透明、组织再生能力强、易于饲养、实验成本低和培育周期短等优点；且相对于小鼠等哺乳动物模型，斑马鱼发育过程中母源基因的突变或敲除不易导致胚胎致死，可以实时活体跟踪疾病的发生、发展过程。此外，斑马鱼遗传背景清楚、基因编辑手段成熟、可操作性强，易进行基因编辑、物理化学诱变、转基因和肿瘤细胞植入等建模技术的实施。斑马鱼基因与人类基因同源性高达87％，一般而言，绝大多数癌基因、抑癌基因及细胞周期调控基因等在人和斑马鱼中具有极其高度的保守性，生物学功能相似，因此斑马鱼是可以利用其优势作为研究人类相关基因的一个重要工具。此外，crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/crispr-associatednuclease 9)是目前最主流的基因编辑技术，因其构建效率更高、成本更低、方法更简便，还可同时打靶多个基因，已广泛运用于各种细胞和动物模型的制备中，为研究疾病发生发展、筛选治疗靶点和药物效果等方面提供了有利工具。

3、多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，pcos)是女性中最常见的内分泌疾病，在全球育龄妇女中的发病率约在5％至18％之间，对患病女性产生许多生殖和代谢方面的不良影响，如内分泌疾病、代谢紊乱、生殖障碍和心理问题等。pcos通常表现为肥胖、多毛、月经失调、雄激素水平过高、卵巢囊肿、排卵障碍等，其发病机制复杂，具有多因素和异质性病因，可能是遗传、代谢和环境因素之间相互作用的结果，这些因素的主导及次要作用可能因不同女性个体而异。pcos是由代谢紊乱或下丘脑-垂体-卵巢轴功能障碍引发，具体有类固醇生成障碍、胰岛素抵抗、脂肪沉积(尤其是腹部区域)和高雄激素血症等症状，而这些症状之间相互关联影响，最终导致pcos。例如脂肪沉积或bmi增加会触发卵巢释放更多的雄激素，导致雄激素过量引发高雄激素血症；脂肪沉积同时也会导致胰岛素抵抗，胰岛素抵抗和雄激素分泌过多会导致肥胖和2型糖尿病，从而导致月经周期不规律，内分泌失调，继而引起排卵障碍、不孕症，甚至还有抑郁和焦虑的心理疾病。此外，pcos还会导致一系列的并发症，例如2型糖尿病(t2dm)、肥胖症、不孕、高血压、心血管疾病、子宫内膜癌等，这些并发症可能与pcos的发病机制有关，也可能是pcos的继发性改变。

4、pcbps在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色，其表达水平的变化在肿瘤中发挥调控的相关分子机制虽已有研究，却几乎没有报道研究pcbps在机体内的正常生理功能以及其与多囊卵巢综合征的相关性，由此缺乏与此相关的多囊卵巢综合征动物模型。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种多囊卵巢综合征动物模型的构建方法及其应用。本发明通过模式生物(斑马鱼)成功构建了pcbp2敲除动物模型，且成功的使pcbp2敲除品系斑马鱼可以正常发育至成年期。而且还发现pcbp2敲除导致雌性斑马鱼pcos的发生，并进而发现导致pcos发生的原因之一是pcbp2敲除明显增强了雌性斑马鱼卵巢中炎症反应。本发明还提出了pcbp2在维持卵巢正常生理功能中具有不可或缺的作用，为进一步研究pcbp蛋白在pcos和卵巢炎症中的具体作用机制奠定了初步的理论基础，并为探索pcbp蛋白在脊椎动物中的正常生理功能和在不同疾病中的作用提供了一个良好的动物模型。

2、本发明的第一个方面，提供了一种疾病动物模型的构建方法，包括如下步骤：

3、敲除或沉默实验生物体的pcbp2基因。

4、在本发明的一些实施方式中，敲除或沉默实验生物体的pcbp2基因的12个外显子中的至少一个。

5、在本发明的一些实施方式中，敲除或沉默实验生物体的pcbp2基因的第四个外显子。

6、在本发明的一些实施方式中，所述pcbp2基因的第四个外显子所对应的位点如seqid no:1所示。

7、在本发明的一些实施方式中，所述敲除或沉默包括使用rna干扰、质粒介导的基因敲除、胚胎干细胞敲除、crispr系统、转录激活因子样效应物核酸酶技术(talens)或锌指核酸酶(zfn)技术中至少一种基因编辑技术或物理化学诱变技术进行敲除或沉默。

8、当然，本领域技术人员也可以采用其他能够实现指定基因沉默或敲除的其他技术，包括但不限于上述的rna干扰、质粒介导的基因敲除、胚胎干细胞敲除、crispr系统、talens和zfn。

9、在本发明的一些实施方式中，所述构建方法使用crispr系统进行敲除。

10、在本发明的一些实施方式中，所述crispr系统包括crispr-cas9。

11、当然，本领域技术人员可以根据使用需求，选择其他的crispr系统，包括但不限于cas9、cas12a、cas13a和cas13b。

12、在本发明的一些实施方式中，所述crispr系统中的grna引物如seq id no:2和3所示。

13、当然，本领域技术人员可以根据使用需求，设计得到其他等同效果的grna引物，用于配合相应的crispr系统和对应靶位。

14、在本发明的一些实施方式中，所述疾病包括多囊卵巢综合征和/或其相关疾病状况。

15、在本发明的一些实施方式中，多囊卵巢综合征相关疾病状况包括但不限于：生育能力低下、卵巢炎症、卵巢增大、卵巢囊肿样改变、闭锁卵泡异常增加、卵泡发育异常、卵巢纤维化、促性腺激素分泌异常和雄激素水平异常。

16、在本发明的一些实施方式中，所述生物体包括动物。

17、在本发明的一些实施方式中，所述动物包括鱼类。

18、在本发明的一些实施方式中，所述动物为斑马鱼。

19、在本发明中，所述生物体泛指在对pcbp2基因进行敲除或沉默后能够存活至成年的任意物种，包括但不限于上述的斑马鱼。而斑马鱼作为一种本领域公知的模式生物，能够代表其在广泛物种中的泛用性和可行性。

20、在本发明的一些实施方式中，所述构建方法具体包括：合成grna，将其与cas9体系混合后注入胚胎中，测序筛选分型后即得。

21、本发明的第二个方面，提供了本发明第一个方面所述的构建方法得到的疾病模型在药物筛选中的应用。

22、在本发明的一些实施方式中，所述疾病模型的pcbp2基因发生了突变。

23、在本发明的一些实施方式中，所述突变为碱基增加或缺失。

24、在本发明的一些实施方式中，相较于野生型pcbp2基因，所述疾病模型的pcbp2基因增加或缺失至少1个碱基。

25、在本发明的一些实施方式中，相较于野生型pcbp2基因，所述疾病模型的pcbp2基因增加或缺失5-25个碱基。

26、在本发明的一些实施方式中，相较于野生型pcbp2基因，所述疾病模型的pcbp2基因增加或缺失8-20个碱基。

27、应当理解的是，本发明的目的不在于限定疾病模型中pcbp2基因增加或缺失的数量，在本领域中，任意能够实现移码突变的碱基变化(改变)都应当落入本发明的保护范围。而pcbp2基因存在954个碱基，任意的碱基缺失和增加实际上都会带来表达的实质改变，本发明无法穷举任意数量的碱基变化所带来的移码突变，但本领域技术人员应当理解，对于这种改变，其是容易实现且无需付出额外的创造性劳动的。

28、在本发明的一些实施方式中，相较于野生型pcbp2基因，所述疾病模型的pcbp2基因增加了8个碱基。

29、在本发明的一些实施方式中，相较于野生型pcbp2基因，所述疾病模型的pcbp2基因缺失了20个碱基。

30、在本发明中，野生型斑马鱼pcbp2基因正常编码318个氨基酸，且含有3个长度约为70个氨基酸的kh结构域，而本发明中构建得到的pcbp2+8bp和pcbp2δ20bp这两种突变系因为pcbp2基因组中碱基的增加或缺失，均能使基因发生移码突变，导致蛋白质翻译提前终止，产生截断蛋白。pcbp2+8bp突变体的pcbp2基因编码76个氨基酸，pcbp2δ20bp突变体的pcbp2基因编码69个氨基酸，这两种突变均导致pcbp2蛋白质翻译过程在第一个kh结构域时已提前终止，最终缺失了三个发挥基因功能的完整的kh结构域。

31、本发明第三个方面，提供了本发明第一个方面所述的构建方法得到的疾病模型在制备多囊卵巢综合征风险预测产品中的应用。

32、在本发明的一些实施方式中，通过构建拟合受试者情况，并对比本发明第一个方面所述的构建方法得到的疾病模型来分析和分析多囊卵巢综合征风险。

33、本发明的有益效果是：

34、1.本发明成功的构建得到了两种不同的pcbp2基因敲除斑马鱼品系，而且这些pcbp2敲除品系斑马鱼在胚胎期能正常生长发育并存活至成年期，为后续进一步研究pcbp2的基因功能提供了良好的动物模型。

35、2.本发明中的pcbp2基因敲除斑马鱼品系能够作为多囊卵巢综合征模型，且拟合效果好，构建简单，为进一步研究pcbp蛋白在pcos和卵巢炎症中的具体作用机制奠定了初步的理论基础，并为探索pcbp蛋白在脊椎动物中的正常生理功能和在不同疾病中的作用提供了一个良好的模型支持。