底锅水多糖及其联合氯化胆碱-果糖深共熔溶剂提取方法和应用与流程

本发明属于活性物质提取，具体涉及一种底锅水多糖及其联合氯化胆碱-果糖深共熔溶剂提取方法和应用。

背景技术：

1、白酒是以高粱、大米、小麦、豌豆和玉米等为原料，在发酵剂作用下，经原料粉碎、发酵、蒸馏、贮存及勾调等工艺而制成的蒸馏酒。在我国历史悠久，规模较大。近年来，随着白酒行业的迅速发展，其酿酒副产物(酒糟、废水等)也在大量产出。酿酒废水是白酒生产过程中主要的副产物资源，据不完全统计，每生产1t白酒会产出约48t的废水。其中底锅水是酿酒废水的主要来源之一，是粮食糊化和糟醅蒸馏时水蒸气在糟醅中反复冷凝、下沉聚集在锅底中与原有水分混合形成的液体。此外，在实际生产过程中，也会将黄水加入底锅中一起蒸馏以提高酒的产量，这时底锅水通常为黄褐色或者褐色。底锅水组成成分复杂多样，含有淀粉、还原糖、醇类、有机酸等有机物质，若直接处理不仅难度大、成本高，也会导致其中有机组分未被充分利用而造成资源浪费，因此对底锅水的资源化利用具有重要意义。

2、随着健康饮食观的兴起，提取天然活性成分用于功能性食品、药品等受到广泛关注，多糖是一类由许多相同或不同的单糖以α/β-糖苷键连接而成的天然大分子多聚物，具有抗氧化、抗炎和降血糖等多种活性，在临床治疗和预防疾病方面应用较多。

3、现有技术中关于白酒酿造底锅水资源化利用方面较少，如发明cn115160030a中利用底锅水生产含γ-聚谷氨基酸液态有机肥；发明cn114315046a以酿酒废水为原料制备生物活性发酵滤液，从而有效利用其中有效组分；发明cn116769840a公开了利用酿酒底锅水生产小球藻生长因子的方法。而关于底锅水活性成分制备方面，仅发明cn1176999876a公开了一种酿酒底锅水资源化利用的方法，其中建立了粗多糖提取方法。虽然该方法上在一定程度上回收了底锅水中多糖有益成分，但依然存在如下问题：(1)提取过程繁琐，工业化应用生产难度大、成本高；(2)提取过程需进行浓缩，若不能较好的控制浓缩温度，难以确保多糖结构和活性不受破坏；(3)该技术仅局限于底锅水多糖粗提物制备方法，其分离鉴定方面尚无研究。

4、因此，运用绿色高效的深共熔溶剂对底锅水多糖进行分离纯化，分析其结构特征，探究其功能活性，为其在食品、保健药品及化妆品方面的应用提供理论基础，具有重要现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种联合天然深共熔溶剂(nades)提取分离底锅水多糖的方法。该方法利用nades提取、醇沉、透析、离子交换柱和葡聚糖凝胶柱层析等方法，对底锅水多糖进行分离纯化，并采用扫描电镜、红外和核磁等技术鉴定多糖结构，同时探究其体外抗氧化活性。

2、为实现上述目的，本发明首先提供了一种底锅水多糖的联合氯化胆碱-果糖深共熔溶剂提取方法，其包括以下步骤：

3、a、将酿酒底锅水静置离心后，将离心后的底锅水与深共熔溶剂混合，在超声条件下，进行液液萃取，得到提取液；步骤a中，所述深共熔溶剂由以下方法制备得到：按照摩尔比为1：1～4，取氯化胆碱和果糖混合均匀后，加入氯化胆碱和果糖总质量10～40％的水，加热搅拌(促使各组分之间氢键的形成)直至形成均一稳定澄清透明的液体，即得氯化胆碱-果糖nades；

4、b、将步骤a所得提取液经冷却、醇沉、固液分离和冻干后，得到底锅水粗多糖；

5、c、将步骤b所得底锅水粗多糖配制为水溶液后，加入sevage试剂去除蛋白质，收集上层糖液，然后经透析去除可溶性小分子物质，透析所得溶液经冻干，得底锅水多糖dgsp。

6、其中，上述提取方法，步骤a中，所述酿酒底锅水静置过滤的具体操作为：酿酒底锅水0～4℃静置24～48h后，至少进行一次离心处理，首次离心条件：温度0～4℃，转速8000～10000rpm，时间15～20min；后续离心条件：温度0～4℃，转速5000～8000rpm，时间10～15min。

7、其中，上述提取方法，步骤a中，所述离心后的底锅水与深共熔溶剂的体积比为1：1～2。

8、其中，上述提取方法，步骤a中，所述超声的功率为200～400w。

9、其中，上述提取方法，步骤a中，所述液液萃取的温度为40～60℃。

10、其中，上述提取方法，步骤a中，所述液液萃取的时间为40～60min。

11、优选的，上述提取方法，步骤a中，制备深共熔溶剂时，氯化胆碱和果糖的摩尔比为1：1～2。

12、优选的，上述提取方法，步骤a中，制备深共熔溶剂时，加入氯化胆碱和果糖总质量10～20％的水。

13、其中，上述提取方法，步骤a中，制备深共熔溶剂时，所述加热搅拌的温度为80～90℃。

14、其中，上述提取方法，步骤a中，制备深共熔溶剂时，所述加热搅拌的时间为5～6h。

15、其中，上述提取方法，步骤b中，所述醇沉为：将提取液和无水乙醇按照体积比1：3～5混合，在0～4℃下静置沉淀24～48h。

16、其中，上述提取方法，步骤b中，所述固液分离采用离心。

17、优选的，上述提取方法，步骤b中，固液分离时，所述离心为：在温度0～4℃和转速8000～10000rpm的条件下，离心15～20min，收集沉淀。

18、其中，上述提取方法，步骤b中，所述冻干的条件为：温度-80～-60℃，真空度1～2pa，时间24～48h。

19、其中，上述提取方法，步骤c中，将底锅水粗多糖配置成浓度10～20mg/ml的水溶液。

20、其中，上述提取方法，步骤c中，底锅水粗多糖水溶液和sevage试剂的体积比为4～5：1。

21、其中，上述提取方法，步骤c中，所述收集上层糖液采用离心。

22、优选的，上述提取方法，收集上层糖液时，所述离心为：在温度0～4℃和转速5000～8000rpm的条件下离心10～15min，收集上层糖液。

23、其中，上述提取方法，步骤c中，所述透析为：利用透析袋在0～4℃下透析36～48h以截留分子量大于3500da的组分，期间每隔6～8h更换一次水。

24、其中，上述提取方法，步骤c中，所述冻干的条件为：温度-80～-60℃，真空度1～2pa，时间24～48h。

25、本发明还提供了一种底锅水多糖的联合氯化胆碱-果糖深共熔溶剂提取方法，其在上述方法的基础上，还包括以下步骤：

26、d、将步骤c所得底锅水多糖dgsp配制成水溶液后，先采用阴离子交换柱层析纯化，得到底锅水多糖dgspx，再采用葡聚糖凝胶柱层析纯化，得到底锅水多糖dgspb-1。

27、其中，上述提取方法，步骤d中，将步骤c所得底锅水多糖dgsp配置成浓度10～20mg/ml的水溶液。

28、其中，上述提取方法，步骤d中，所述阴离子交换柱层析纯化的操作为：将底锅水多糖dgsp水溶液上样至deae52阴离子交换纤维素柱，洗脱液依次为0～0.4mol/l nacl溶液，期间用苯酚-硫酸法测定多糖含量，接至无多糖液体流出，分别收集0mol/l、0.1mol/l和0.4mol/l时的有效多糖组分，经透析和冻干，得到底锅水多糖dgspx，所述底锅水多糖dgsp包括dgspa、dgspb和/或dgspc，其中，0mol/l时的有效多糖组分对应得到dgspa，0.1mol/l时的有效多糖组分对应得到dgspb，0.4mol/l时的有效多糖组分对应得到dgspc。

29、步骤d中，阴离子交换柱层析纯化时，dgspb为主要洗脱峰，其余两个吸光度值较低。因此优选的，上述提取方法，步骤d中，所述阴离子交换柱层析纯化的操作为：将底锅水多糖dgsp水溶液上样至deae52阴离子交换纤维素柱，洗脱液依次为0～0.1mol/l nacl溶液，期间用苯酚-硫酸法测定多糖含量，接至无多糖液体流出，收集0.1mol/l时的有效多糖组分，经透析和冻干，得到dgspb。

30、优选的，上述提取方法，步骤d中，阴离子交换柱层析纯化时，洗脱液流速为1～2ml/min，每4～5ml收集一管。

31、优选的，上述提取方法，步骤d中，阴离子交换柱层析纯化时，所述透析为：利用透析袋在0～4℃下透析36～48h以截留分子量大于3500da的组分，期间每隔6～8h更换一次水。

32、优选的，上述提取方法，步骤d中，阴离子交换柱层析纯化时，所述冻干的条件为：温度-80～-60℃，真空度1～2pa，时间24～48h。

33、其中，上述提取方法，步骤d中，将阴离子交换柱层析纯化所得dgspb配置成浓度10～20mg/ml的水溶液。

34、其中，上述提取方法，步骤d中，所述葡聚糖凝胶柱层析纯化的操作为：将阴离子交换柱层析纯化所得dgspb配置成水溶液，上样至sephadex g-100葡聚糖凝胶柱层析，洗脱液为水，期间用苯酚-硫酸法测定多糖含量，接至无多糖液体流出，收集有效多糖组分，经透析和冻干，得到底锅水多糖dgspb-1。

35、优选的，上述提取方法，步骤d中，葡聚糖凝胶柱层析纯化时，洗脱液流速为1～2ml/min，每4～5ml收集一管。

36、优选的，上述提取方法，步骤d中，葡聚糖凝胶柱层析纯化时，所述透析为：利用透析袋在0～4℃下透析36～48h以截留分子量大于3500da的组分，期间每隔6～8h更换一次水。

37、优选的，上述提取方法，步骤d中，葡聚糖凝胶柱层析纯化时，所述冻干的条件为：温度-80～-60℃，真空度1～2pa，时间24～48h。

38、本发明通过凝胶渗透色谱仪(gpc)测定纯化后多糖组分分子量；扫描电镜、红外光谱和核磁共振分析多糖理化性质。其中，上述提取方法，步骤d中，所述底锅水多糖dgspb-1的分子量为11.8832kda，其单糖组成的摩尔比为glc：rib：rha：man：glca：gal：xyl：ara＝26.97：3.03：0.68：52.44：5.31：3.44：2.68：5.45。

39、本发明还提供了底锅水多糖dgsp、底锅水多糖dgspx和/或底锅水多糖dgspb-1，其采用上述方法提取所得。

40、本发明以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)自由基和羟基(oh)自由基和总抗氧化能力为指标评价底锅水多糖抗氧化活性。经试验，本发明底锅水多糖dgsp、底锅水多糖dgspx和/或底锅水多糖dgspb-1具有优异的自由基清除能力，因此本发明还提供了上述底锅水多糖dgsp、底锅水多糖dgspx和/或底锅水多糖dgspb-1在制备自由基清除剂中的应用。

41、优选的，上述用途中，所述自由基为dpph自由基和/或oh自由基。

42、本发明中，白酒酿造废水底锅水为本领域公知物质，其可参考文献1(罗玉婷，张煜亮，税梁扬等.四尾栅藻处理白酒酿造废水底锅水的研究[j].现代化工，2024，44(02)：206-210)、文献2(姜翰达，严鹿鸣，李蓉等.白酒酿造底锅水资源化生产小球藻生长因子[j].化学与生物工程，2024，41(07)：37-43)等文献。

43、本发明的有益效果：

44、本发明制备的氯化胆碱-果糖nades溶剂绿色高效，可作为底锅水多糖物质的良好提取剂。考虑到底锅水组成复杂，在进行提取前首先对底锅水进行了预处理，低温静置、离心等方式最大限度的将底锅水中不溶性杂质去除，该法温和，不破坏底锅水中有效成分的化学结构；提取过程中底锅水与氯化胆碱-果糖nades溶剂按不同体积比进行添加以调节提取液的极性，以确保底锅水中不同极性的多糖分子溶出，提高提取含量和效率。

45、sevage试剂中以无毒的二氯甲烷替代危险化学品三氯甲烷，确保提取过程无危险化学品的使用，同时又能有效去除粗多糖中的蛋白质、色素等杂质，便于后续分析。利用deae52阴离子交换纤维素柱和sephadex g-100葡聚糖凝胶柱层析纯化底锅水粗多糖，并对纯化后的底锅水多糖进行结构判定。本发明不仅从底锅水中有效提取多糖物质，还进一步分离出底锅水多糖，并解析其分子量、单糖组成、结构和抗氧化能力等，说明该分离鉴定方法有效可行，分析结构准确可靠，弥补了现有底锅水多糖分离鉴定的空白，解决现有技术中分离鉴定底锅水多糖的难题。