一种利用酵母孢子固定化β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶的方法、应用及其产品与流程

本发明属于酶固定化，具体涉及一种利用酵母孢子固定化β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶的方法、应用及其产品。

背景技术：

1、甘露聚糖(mannan)是一种重要的植物半纤维素聚多糖，广泛存在于豆科植物细胞壁中。水解后的甘露低聚糖(mos)是一种功能性营养物质，能够改善肠道菌群，在食品、饲料、造纸纺织、石油工业等领域应用广泛。甘露聚糖水解涉及几种不同的酶，起主要作用的为内切β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶。

2、孢子固定化酶是采用基因工程技术将含有目的酶基因的质粒转入酿酒酵母，酿酒酵母产孢过程中孢子壁从内到外依次组装甘露糖层、β-葡聚糖层、壳聚糖层和二酪氨酸层，在组装过程中目标酶从孢子膜内腔被固定到壳聚糖层和二酪氨酸层之间。

3、现有技术cn109182302a公开了一种利用酵母孢子固定化纤维素酶的方法，成功获得了能够在孢子二酪氨酸层与壳聚糖层之间固定的半纤维素酶，通过对该固定化的半纤维素酶进行检测，发现固定化酶的最适温度提高到75℃、最佳反应ph值降低为3.2，在磷酸盐浓度20mmol/l、mg2+浓度15mmol/l以内时，酶活最高。

4、迄今为止，已经从不同微生物中克隆并在异源宿主细胞中表达了游离型β-甘露聚糖酶与β-木聚糖酶。但游离酶在工业应用中存在较大的局限性，例如，甘露聚糖酶与木聚糖酶在高温、强酸碱等极端条件下容易失活，并且不易于从反应体系中分离出来，同时，游离酶的加入也不利于低聚甘露糖与低聚木糖的纯化与精制。因此，构建性能优异的重组β-木聚糖酶以及β-甘露聚糖酶，并固定化提升其耐酸碱性及可重复利用性，具有重要的应用价值和经济效益。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用酵母孢子固定化甘露聚糖酶和木聚糖酶的方法、应用及其产品。

2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种酵母孢子固定化β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶的方法，所述方法包括以下步骤：

4、(1)β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶目的基因的合成；

5、(2)构建重组质粒分别转化到表达菌株；

6、(3)诱导表达菌株产孢固定化β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶。

7、具体的，所述β-甘露聚糖酶来源于aspergillus niger，其核苷酸序列如sed idno：1所示。

8、具体的，所述β-木聚糖酶来源于aspergillus niger，其核苷酸序列如sed id no：2所示。

9、seq id no 1:

10、atgaagctttccaacgccctcctcaccctggctagcctggcgctggccaacgtctccacggctctgccgaaagcctcccctgcaccgagcaccagcagcagtgctgcctccacctccttcgccagcacctccggcctccaattcaccattgatggcgaaactggctacttcgccggaacgaacagctactggatcggtttcctcactgacaacgcggacgtcgacctcgtcatgggccacctgaagtcgtccggcctcaagatcctccgcgtgtggggcttcaacgatgtcacctcgcagccctcctccggcacagtctggtaccaactgcaccaggacggcaaatcgacaatcaacacgggtgccgacggtctccagcgcctcgactacgtcgtctcgtctgccgaacagcacgacatcaaactcatcatcaacttcgtcaactactggaccgattacggtggtatgtctgcgtacgtgagcgcgtatggcggatccggcgagacggatttctataccagtgataccatgcagagtgcctatcagacatatatcaagacggtcgtggagcggtacagtaactcctcggcggtgtttgcgtgggagttggcgaatgagccgagatgtccgagttgcgatacttctgtgttgtataactggattgagaagacgagtaagtttattaaggggttggatgcggatcgtatggtttgtattggtgatgagggcttcggtctcaacatcgactcggacggcagctacccttatcaattctccgagggcttgaactttacgatgaacctcggtatcgatactattgactttggtaccctccacttgtaccctgatagctggggcacctccgacgactggggcaacggctggatcaccgcccacggcgcagcctgcaaagcggccggcaagccatgtctcctggaggaatacggagtcacctcgaaccactgcagtgtggagggctcgtggcagaagacagcgctcagcacaacgggcgtcggcgcggatctgttctggcagtatggtgatgatttgagtaccgggaagtcgccggatgatgggaatactatctactatgggactagtgattatcagtgcctggtgacggatcatgttgctgctattggtagtgcttaa。

11、seq id no 2:

12、gactctgtcgcccagcgttcggatgccttgcacatgctctctgagcgctcgaccccgagctcgaccggcgagaacaacggcttctactactccttctggaccgacggcggtggcgacgtgacctacaccaacggagatgctggtgcctacactgttgagtggtccaacgtgggcaactttgtcggtggaaagggctggaaccccggaagtgcgcaggacatcacctacagcggcaccttcacccctagcggcaacggctatctctccgtctatggctggaccactgaccccctgatcgagtactacatcgtcgagtcctacggcgactacaaccccggcagtggaggcacatacaagggcaccgtcacctcggacggatccgtttacgatatctacacggctacccgtaccaatgctgcttccattcagggaaccgctaccttcactcagtactggtccgtccgccagaacaagagagttggcggaactgttaccacctccaaccacttcaatgcttgggctaagctgggaatgaacctgggtactcacaactaccagatcgtggctaccgagggttaccagagcagtggatcttcgtccatcactgttcagtaa。

13、其中，编码β-甘露聚糖酶的基因命名为mana；编码β-木聚糖酶的基因命名为xynb。

14、具体的，所述重组质粒为prs424或prs426。

15、优选的，所述重组质粒为prs424。

16、进一步具体的，所述mana基因插入位点为ecori/xhoi。

17、进一步具体的，所述xynb基因插入位点为ecori/noti。

18、具体的，所述表达菌株为野生型酿酒酵母菌株或者缺陷型酿酒酵母菌株。

19、在一些实施例中，所述表达菌株为野生型酿酒酵母菌株。

20、进一步具体的，所述表达菌株为野生型酿酒酵母菌株an120。

21、其中，所述的野生型酿酒酵母菌株an120的信号肽为带有spr1基因的分泌信号肽。

22、在上述实验步骤(3)中所述产孢还包括重组菌株培养基培养、沉降收集菌体、沉降收集孢子沉淀。

23、具体的，所述培养基组分包括：蛋白胨、酵母提取物、乙酸钾和腺嘌呤。

24、进一步具体的，所述孢子沉淀保存在-30℃到-10℃。

25、另一方面，本发明公开了上述β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶在酵母孢子固定中的作用。

26、又一方面，本发明还公开了一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括前述任意一项方法所制备的酵母孢子。

27、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

28、本发明以野生型酿酒酵母子囊孢子为固定化酶载体，固定了β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶，通过将黑曲霉来源的基因转入酿酒酵母中，在酵母孢子中表达带有分泌型信号肽的β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶，由于酶被致密网状结构的二酪氨酸层所阻挡，在孢子壁形成过程中被固定在壳聚糖层与二酪氨酸层之间，从而得到了孢子固定化酶，酶的表达与固定化同时进行。不再需要外源添加两种酶，大幅降低原料成本，得到的酶可重复利用率高，抗逆性强。