一种从头合成羟基酪醇的菌株及其应用

本发明涉及一种从头合成羟基酪醇的菌株及其应用，属于生物。

背景技术：

1、羟基酪醇，又名二羟基苯乙醇，是一种多酚类化合物，主要存在与橄榄油中。羟基酪醇具有多种药理活性，如抗氧化、抗病毒、抗癌、神经保护和心脏保护。因其抗氧化和清除自由基的能力，羟基酪醇被广泛应用于美容产品中，保护皮肤免受紫外线等外界因素的伤害，延缓皮肤老化。此外，羟基酪醇已获得fda的gras(generally recognized as saf)认证，其安全性被广泛认可，并作为抗氧化剂或抗菌剂广泛应用于多种食品中。羟基酪醇在食品、医药、化工、化妆品等领域展现出的广阔应用潜力引起了人们极大关注。在2024年，全球羟基酪醇市场价值估计为7.512亿美元。到2034年，总市场估值可能达到14.255亿美元。

2、羟基酪醇可以通过多种渠道获得。过去人们常常依赖于从植物中提取。植物提取法尽管能利用天然资源，但是提取过程复杂，产物质量也易受到地理、气候、环境以及产物含量等限制。此外，化学合成也可以合成羟基酪醇，但是反应起始原料及催化剂价格昂贵，且可能会涉及到高温、高压以及危险化学品的使用等，因此也不是首选方法。近些年合成生物学的发展为细胞工厂构建提供了强大动力，通过精细的系统改造实现微生物高效合成目标产物。与传统化石基础的生产模式相比，这种绿色的生物制造工艺体现了环境友好性和可持续性，具有非常大的潜力。

3、目前已知的羟基酪醇的作用有多种：(1)抗氧化作用：能够清除自由基，保护细胞免受氧化应激的损害，增强皮肤弹性和润泽，已应用于面霜、防晒霜等产品，也可作为食品添加剂防止食物变质；(2)保护心血管健康：在预防和治疗心血管疾病方面显示出潜力，包括抗动脉粥样硬化、抗高血压和抗血栓形成；(3)抗癌防癌：能够防治肺癌、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌等，并促进癌症后期恢复和提高化疗效果；(4)抗炎作用：能够对抗炎症性疾病；(5)神经保护：对神经退行性疾病具有潜在的预防作用，能够保护神经细胞；(6)抗菌、抗病毒：可作为天然的抗菌、抗病毒产品用于农业和虫害控制。

4、在现有报道当中，虽然已有安全高效的生物法合成酪醇，例如：通过在大肠杆菌中表达hpabc、laad、aro10、adh6等基因使羟基酪醇产量摇瓶产量达到3.12g/l(文章《promoting fadh2 regeneration of hydroxylation for high-level production ofhydroxytyrosol from glycerol in escherichia coli》)，然而产量有待进一步提高。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种生物合成羟基酪醇的方法。利用现代生物基因工程的技术，在已有酪醇高产菌株的基础上构建了一株高产羟基酪醇的方法(代谢途径的改造方法如图3所示)，且发酵不需要诱导剂，目的在于解决现有技术中利用生物法合成酪醇的产量有待进一步提高的技术问题。

2、本发明提供的第一个技术方案为一种重组大肠杆菌，以大肠杆菌ymgrh1d1为宿主细胞，敲除基因ptsg后表达了来源于大肠杆菌的葡糖激酶基因glk。

3、在某些实施方式中，所述大肠杆菌ymgrh1d1的菌种保藏号为cctcc no：m2019390，所述大肠杆菌记载于公开号为cn112813013a的中国专利申请文本中，命名为e.coliymgrh1d1。

4、在某些实施方式中，所述葡糖激酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、在某些实施方式中，所述葡糖激酶基因glk的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、本发明提供的第二个技术方案为一种构建第一个技术方案所述重组大肠杆菌的方法，所述方法是将葡糖激酶基因glk插入到质粒pkk223-3中，并转化至敲除了基因ptsg的大肠杆菌ymgrh1d1中，获得所述重组大肠杆菌。

7、在某些实施方式中，所述方法包括以下步骤：

8、(1)重组质粒pkk223-glk的构建：以大肠杆菌e.coli mg1655基因组为模板；引物glk-l、glk-r进行pcr获得glk(gene id:946858)基因，并插入到质粒pkk223-3中，获得重组质粒pkk223-glk；

9、(2)ptsg敲除表达盒的构建：设计引物，采用pcr扩增得到片段ptsg-u、ptsg-d连接，并上述片段进行连接，获得ptsg删除表达盒；

10、(3)采用crispr-cas9的方法，先将pcas质粒采用电转化的方法转化进入大肠杆菌ymgrh1d1感受态细胞中，然后将带有sgrna的质粒sg-ptarget及ptsg的删除表达盒电转化进入大肠杆菌ymgrh1d1/pcas感受态细胞中；挑取转化子进行菌落pcr验证，将验证正确的菌株，利用iptg进行诱导，消除sg-ptarget质粒，构建得到重组大肠杆菌，命名为e.coli htδ；

11、(4)重组质粒pkk223-glk的转化：通过化学转化的方式将步骤(1)的重组质粒pkk223-glk转入e.coli htδ，获取工程菌e.coli htδ-glk。

12、在某些实施方式中，步骤(1)中，glk基因从大肠杆菌e.coli mg1655基因组中经pcr的方法获得，并插入到质粒pkk223-3的ecor i与pst i位点，获得重组质粒pkk223-glk。

13、本发明还提供的第三个技术方案为一种生产羟基酪醇的方法，所述方法为采用第一个技术方案所述的重组大肠杆菌发酵生产羟基酪醇。

14、在某些实施方式中，所述方法为，将所述重组大肠杆菌接种至种子培养基中培养，制备得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中，发酵制备羟基酪醇。

15、在某些实施方式中，将所述重组大肠杆菌接种至lb固体培养基上培养，得到单菌落，挑取单菌落接种于lb液体培养基中，于36～38℃、180-220r/min条件下培养10～12h，制备得到种子液。

16、在某些实施方式中，将述重组大肠杆菌接种至lb固体培养基上划线培养，挑取单菌落接种于装有20ml lb液体培养基的100ml锥形瓶中，于36～38℃、180-220r/min条件下培养10～12h，制备得到种子液。

17、在某些实施方式中，将制备得到的种子液接种至lb液体培养基中，在36～38℃、180-220r/min条件下培养8～10h后收集菌体；将收集得到的菌体接种至m9y*液体培养基中进行发酵培养，制备得到羟基酪醇。

18、在某些实施方式中，所述种子液按照接种量为1％(v/v)的比例接种于装有100mllb液体培养基的500ml锥形瓶中，于37℃、200r/min培养10h后收集菌体，并用生理盐水清洗菌体一次。转入装有50ml m9y*液体培养基的250ml锥形瓶中，于30℃、200r/min培养48h。

19、本发明还提供的第四个技术方案为第一个技术方案所述的重组大肠杆菌、第二个技术方案所述的方法或第三个技术方案所述的方法在制备羟基酪醇及含有羟基酪醇的产品中的应用。

20、本发明的技术效果如下：

21、(1)采用本发明提供的重组大肠杆菌e.coli htδ-glk能够实现将葡萄糖和甘油转化为羟基酪醇，并且，在发酵过程中无需添加诱导剂；因此本发明的原材料廉价易得，无危害人体健康的添加剂、重金属和抗生素，为后期的产物提纯奠定良好的基础，更能够达到商业应用的要求。

22、(2)采用本发明提供的重组大肠杆菌e.coli htδ-glk在葡萄糖和甘油的培养基中发酵生产羟基酪醇的产量可高达4.27g/l，高于目前绝大多数研究团队的结果。

23、(3)采用本发明构建的重组菌株e.coli htδ-glk发酵生产羟基酪醇，在84h羟基酪醇的产量是采用ymgrh1d1发酵生产羟基酪醇的产量的3.62倍。