一种宏基因组dna的提取方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种宏基因组DNA的提取方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 宏基因组（the genomes of the total microbiota found in nature)是指生境 中全部微生物基因的总和，它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和。人类生活在 一个微生物的世界，作为一个完整的人体，真核细胞仅占细胞总数的10%，而90%是原核 细胞，因此诺贝尔奖获得者Lederberg提出人体是由真核细胞与体内共生的原核细胞共同 组成的"超级生物体（Super organism)"。
[0003] 越来越多研宄表明，人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制。有许多现 象，例如对疾病的易感性、药物反应等，无法全部用人体基因的差异来解释。而体内菌群的 组成和活动与人的生长发育、生老病死息息相关。因此，宏基因组研宄已经成为目前微生物 生态学和生物医学研宄的新热点。
[0004] 宏基因组学研宄的对象是特定环境中的总DNA，因此，DNA的提取是宏基因组研宄 成功的关键步骤。提取步骤通常需要满足两个条件：既要尽可能提取样品所有微生物的基 因，又要保持片段的完整和纯度。
[0005] 目前所开发的DNA提取方法有两种：细胞提取法和直接裂解法。但这些常规提取 细菌DNA的方法往往只能针对革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌中的一类，缺乏通用性， 所得宏基因组DNA丰度欠佳。有些方法虽能更好的提取多种生物中的基因组DNA，但却存在 操作繁琐、成本高、得率低的弊端。
[0006] 因此，进一步开发宏基因组DNA的提取方法，提高提取丰度、片段完整性和纯度， 并降低成本是十分必要的。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种宏基因组DNA的提取方法及其 试剂盒，本发明提供的方法和试剂盒能够提高丰度、片段完整性和纯度，且操作简单，成本 较低。
[0008] 本发明提供的基因组DNA的提取方法包括：取待测样品与裂解液混合后，经溶菌 酶溶液处理、震荡破壁、蛋白酶K处理后，经NaCl处理、异丙醇处理、乙醇洗涤，即得；
[0009] 溶菌酶溶液的pH值为8. 0,其中包括：20mM Tris-Cl、2mM EDTA、体积分数为1. 2% 的 Triton X-100、溶菌酶 20mg/mL。
[0010] 溶菌酶的作用在于破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的 β -1，4糖苷键，使微生物细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物 逸出而使细菌溶解。
[0011] 作为优选，溶菌酶溶液的配制方法为现用现配，预先配制溶菌酶缓冲液，用前加入 溶菌酶粉末溶解，经超滤，低温离心机12000rpm离心20min，即得。
[0012] 优选的，超滤采用IOOkDa超滤管。
[0013] 优选的，溶菌酶缓冲液包括：20mM Tris-Cl、2mM EDTA、体积分数为1. 2%的Triton X-IOOo
[0014] 裂解液的加入一方面可以破裂微生物的细胞，另一方面也阻止了菌类的增殖，本 发明提供方法所采用的裂解液中包括：50mM Tris、50mM EDTA、50mM蔗糖、IOOmM NaCl、质量 分数为I %的SDS，pH值为8· 0。
[0015] 作为优选，震荡破壁具体为：取玻璃珠与经溶菌酶溶液处理的样品混合，以组织细 胞破碎仪震荡5min后，以涡旋振荡20min。
[0016] 优选的，玻璃珠的直径为0· lmm、0. 5mm和I. Omm，其中，直径0· Imm玻璃珠、直径 0. 5mm玻璃珠和直径I. Omm玻璃珠的体积比为1: 1:1。
[0017] 作为优选，待测样品与裂解液混合的体积比为1:1。
[0018] 作为优选，溶菌酶溶液处理的温度为37°C，时间为30min。
[0019] 作为优选，溶菌酶溶液与待测样品的体积比为9:50。
[0020] 利用无菌的玻璃珠进行打击，充分的破裂细胞壁，保证细胞壁较厚的革兰氏阳性 菌也能充分破裂。
[0021] 作为优选，蛋白酶K处理的温度为53°C，时间为8h?12h。
[0022] 优选的，蛋白酶K处理采用蛋白酶K溶液。其质量体积浓度为20mg/mL。
[0023] 优选的，蛋白酶K处理具体为：经震荡破壁的样品加入1. 5%倍体积的蛋白酶K溶 液和7%?8%倍体积的SDS溶液，53°C孵育8h?12h后，95°C孵育lOmin。
[0024] 作为优选，NaCl处理具体为：取经蛋白酶K处理的样品与1?3倍体积5mol/L NaCl混合，(TC孵育lOmin，经离心取上清液。
[0025] 作为优选，异丙醇处理具体为：取经NaCl处理的上清液，与3?5倍体积异丙醇混 合，18?30°C孵育lOmin，经离心取沉淀。
[0026] 优选的，以本发明提供的方法提取唾液宏基因组DNA包括以下步骤：
[0027] 步骤1 :取唾液样品与裂解液以体积比为1:1混合后，加入溶菌酶溶液，37°C处理 30min，制得第一细胞溶液，溶菌酶溶液加入量为待测样品体积的18% ;
[0028] 步骤2 :以体积比为1: 1:1取直径为0· Imm玻璃珠、0· 5mm玻璃珠和I. Omm玻璃 珠，与第一细胞溶液混合，以组织细胞破碎仪震荡5min后，以涡旋震荡20min，8000rpm离心 5min取第一上清液；
[0029] 步骤3 :取第一上清液加入1. 5%体积的蛋白酶K溶液和7%?8%倍体积的SDS 溶液，53°C孵育8h?12h后，95°C孵育lOmin，制得第二细胞溶液；
[0030] 步骤4 :取第二细胞溶液，加入0. 2倍体积的NaCl溶液，NaCl溶液的摩尔浓度为 5mol/L，0°C孵育 IOmin 后，13000rpm 离心 10min，取第二上清液；
[0031] 步骤5 :取第二上清液，与60%?70%体积的异丙醇混合，18?30°C孵育IOmin 后，13000rpm离心15min，取沉淀；
[0032] 步骤6 :取沉淀，以3?5倍体积的乙醇水溶液洗涤2次，晾干后用50 μ L TE缓冲 液溶解，即得。
[0033] 更优选的，唾液样品的取法具体为：
[0034] 步骤1 :唾液样品提供者在收集唾液前30分钟内无饮食，无咀嚼口香糖；
[0035] 步骤2 :唾液样品提供者用舌尖顶住上颚或按摩唾液样品提供者两侧颊部，保持 2min后，将唾液含于口中，轻柔的刷洗两颊约10秒钟；
[0036] 步骤3 :取装有裂解液的离心管，唾液样品提供者低头，张口，使唾液自然沿下唇 流出，收集唾液的体积与裂解液体积相等时，停止收集。
[0037] 本发明提供的提取方法在提取唾液宏基因组DNA、细菌或真菌总DNA中的应用。
[0038] 作为优选，细菌为大肠杆菌。
[0039] 作为优选，真菌为枯草芽孢杆菌或细黄链霉菌。
[0040] 本发明通过在提取前加入裂解液和溶菌酶，并调节提取条件，使微生物细胞壁更 易破碎，DNA分子更多的溶出，从而保证了提取所得DNA的丰度、片段完整性和纯度，且操作 简单，成本较低。
[0041] 本发明还提供了一种提取唾液宏基因组DNA、细菌或真菌总DNA的试剂盒，包括： 溶菌酶溶液；
[0042] 溶菌酶溶液的pH值为8. 0,其中包括：20mM Tris-Cl、2mM EDTA、体积分数为1. 2% 的 Triton X-100、溶菌酶 20mg/mL。
[0043] 作为优选，试剂盒中还包括：玻璃珠、裂解液和蛋白酶K ;
[0044] 裂解液的 pH 值为 8. 0,其中包括：50mM Tris、50mM EDTA、50mM 蔗糖、IOOmM NaCl、 质量分数为1%的SDS ;
[0045] 玻璃珠的直径为0· lmm、0. 5mm和I. Omm ;
[0046] 优选的，试剂盒中还包括：质量分数为10%的SDS溶液、摩尔浓度为5M的NaCl溶 液、异丙醇、TE缓冲液和体积分数为70%的乙醇水溶液。
[0047] 更优选的，TE缓冲液的pH值为8. 0,其中包括！IOmMTris-HCl和ImM EDTA。
[0048] 本发明提供的基因组DNA的提取方法包括：取待测样品与裂解液混合后，经溶菌 酶溶液处理、震荡破壁、蛋白酶K处理后，经NaCl处理、异丙醇处理、乙醇洗涤，即得；本发明 通过在提取前加入裂解液和溶菌酶，并调节提取条件，使微生物细胞壁更易破碎，DNA分子 更多的溶出，从而保