方法：
[0111] 取大肠杆菌培养液I. 5mL，与I. 5mL裂解液混合后加入270 μ L溶菌酶溶液，混匀， 置于37°水浴锅中孵育30min;
[0112] 在有帽管中加入1/5左右的玻璃珠（直径0. lmm、0. 5mm、I. Omm的玻璃珠等比例混 匀），加入孵育后的唾液样本，用组织细胞破碎仪振荡5min，涡旋振荡20min后，8000rpm离 心5min上述液体，使玻璃珠沉淀，取上清液。
[0113] 在上清液中加入45以1^蛋白酶1^(2〇11^/1111)，和225以110%505，充分混匀，置于 53°C水浴锅孵育8?12h (中间隔一段时间最好振荡一次）；取过夜的样本于95°C水浴锅中 孵育IOmin ;
[0114] 将孵育后的样品置于冰块上冷却，加入600 μ L5MNaCl，稍微混匀，冰上孵育 10min，13000rpm 离心 lOmin，取上清；
[0115] 将上清液转出到新的15mL离心管，加入2250 yL 100%异丙醇，室温下孵育 lOmin，同时柔和地上下颠倒管子，13000rpm离心15min，取沉淀；
[0116] 用1500 yL 70%乙醇洗涤沉淀2次，13000rpm离心5min，取沉淀在空气中晾干 (用时5?IOmin)，用50 μ L TE缓冲液溶解沉淀，即得。
[0117] 实施例4细黄链霉菌总DNA提取
[0118] 试剂配制：
[0119] 裂解液中包括：50mMTris、50mM EDTA、50mM 蔗糖、100mMNacl、l% SDS，以双蒸水配 制，调节pH 8. 0。
[0120] 溶菌酶缓冲液中包括：20mMTris-Cl、2mMEDTA、L 2% Triton X-100,以双蒸水配 制，调节pH 8. 0。
[0121] 溶菌酶溶液的配制：使用前，在溶菌酶缓冲液中加入溶菌酶，至浓度为20mg/mL， 混合溶解，用IOOkDa超滤管超滤，低温离心机12000rpm离心20min，即得。
[0122] 取细黄链霉菌培养液I. 5mL，与I. 5mL裂解液混合后加入270 μ L溶菌酶溶液，混 匀，置于37°水浴锅中孵育30min;
[0123] 在有帽管中加入1/5左右的玻璃珠（直径0. lmm、0. 5mm、I. Omm的玻璃珠等比例混 匀），加入孵育后的唾液样本，用组织细胞破碎仪振荡5min，涡旋振荡20min后，8000rpm离 心5min上述液体，使玻璃珠沉淀，取上清液。
[0124] 在上清液中加入45以1^蛋白酶1^(2〇11^/1111)，和225 4 110%505，充分混勾，置于 53°C水浴锅孵育8?12h (中间隔一段时间最好振荡一次）；取过夜的样本于95°C水浴锅中 孵育IOmin ;
[0125] 将孵育后的样品置于冰块上冷却，加入600 μ L5MNaCl，稍微混匀，冰上孵育 10min，13000rpm 离心 lOmin，取上清；
[0126] 将上清液转出到新的15mL离心管，加入2250 yL 100%异丙醇，室温下孵育 lOmin，同时柔和地上下颠倒管子，13000rpm离心15min，取沉淀；
[0127] 用1500 yL 70%乙醇洗涤沉淀2次，13000rpm离心5min，取沉淀在空气中晾干 (用时5?IOmin)，用50 μ L TE缓冲液溶解沉淀，即得。
[0128] 对比例1采用现有试剂盒提取唾液样品宏基因组DNA
[0129] 采用实施例1提供的取样方法进行取样，采用购自莱楓（Iifefeng)试剂盒对唾液 样品的宏基因组DNA进行提取。操作参照试剂盒说明书。
[0130] 对比例2采用现有试剂盒提取枯草芽孢杆菌总DNA
[0131] 采用购自天根的试剂盒对枯草芽孢杆菌的总DNA进行提取，操作参照试剂盒说明 书。
[0132] 对比例3采用现有试剂盒提取大肠杆菌DNA
[0133] 采用购自天根的试剂盒对大肠杆菌的总DNA进行提取，操作参照试剂盒说明书。
[0134] 对比例4采用现有试剂盒提取细黄链霉菌总DNA
[0135] 采用购自天根的试剂盒对细黄链霉菌的总DNA进行提取，操作参照试剂盒说明 书。
[0136] 实施例5实施例1?4及对比例1?4提取的DNA质量鉴定
[0137] 取实施例1?4及对比例1?4所提取的DNA为模板，以
[0138] 16S rRNA_Primer_F :AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 和
[0139] 16S rRNA_Primer_R :TACGGYTACCTTGTTACGACTT 为引物，
[0140] 进行PCR扩增；
[0141] 扩增体系为：25 μ L 体系，其中 PCR Mix 12. 5 μ L，Primer F 0· 5 μ L (20 μ Μ)，Primer R 0· 5ul (20 μ Μ)，DNA 模板 1 μ L，最终用双蒸水补齐到 25 μ L。
[0142] 扩增程序为：
[0143]
【主权项】
1. 一种基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括：将待测样品与裂解液混合，经溶菌 酶溶液处理、震荡破壁、蛋白酶K处理后，经NaCl处理、异丙醇处理、乙醇洗涤，即得； 所述溶菌酶溶液的pH值为8.0,其中包括：20mM Tris-Cl、2mM EDTA、体积百分数为 1.2%的 Triton X-100、溶菌酶 20mg/mL。
2. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述震荡破壁具体为：取玻璃珠与经 溶菌酶溶液处理的样品混合，以组织细胞破碎仪震荡5min后，涡旋震荡20min。
3. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述玻璃珠的直径为0. lmm、0. 5mm和 1. 0_，其中，直径0. Imm玻璃珠、直径0. 5mm玻璃珠和直径I. Omm玻璃珠的体积比为1: 1:1。
4. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述裂解液的pH值为8. 0,其中包 括：50mM Tris、50mM EDTA、50mM 蔗糖、IOOmM NaCl、质量分数为 1% 的 SDS。
5. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述待测样品与裂解液的体积比为 1:1〇
6. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶菌酶溶液处理的温度为37°C， 时间为30min。
7. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白酶K处理的温度为53°C，时 间为8h?12h。
8. 如权利要求1?7任一项所述的提取方法在提取唾液宏基因组DNA、细菌或真菌总 DNA中的应用。
9. 一种提取唾液宏基因组DNA、细菌或真菌总DNA的试剂盒，其特征在于，包括：溶菌酶 溶液； 所述溶菌酶溶液的pH值为8. 0,其中包括：20mM Tris-Cl、2mM EDTA、体积分数为1.2% 的 Triton X-100、溶菌酶 20mg/mL。
10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括：玻璃珠、裂解液和蛋白酶K ; 所述裂解液的pH值为8. 0,其中包括：50mM Tris、50mM EDTA、50mM蔗糖、IOOmM NaCl、 质量分数为1%的SDS ; 所述玻璃珠的直径为0. lmm、0. 5mm和I. 0mm。
11. 根据权利要求9或10所述的试剂盒，其特征在于，还包括：质量分数为10%的SDS 溶液、摩尔浓度为5M的NaCl溶液、异丙醇、TE缓冲液和体积分数为70%的乙醇水溶液。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种宏基因组DNA的提取方法。该方法包括：取待测样品与裂解液混合后，经溶菌酶溶液处理、震荡破壁、蛋白酶K处理后，经NaCl处理、异丙醇处理、乙醇洗涤，即得；本发明通过在提取前加入裂解液和溶菌酶，并调节提取条件，使微生物细胞壁更易破碎，DNA分子更多的溶出，从而保证了提取所得DNA的丰度、片段完整性和纯度，且操作简单，成本较低。实验表明，采用本发明提供的方法提取唾液宏基因组DNA或对细菌、真菌的总DNA进行提取，与现有试剂盒相比，所得产物经PCR后电泳条带更加清晰，特别是对唾液样本的提取，所得产物经PCR后电泳条带较用现有试剂盒提取的结果更加清晰，明亮，完整。
【IPC分类】C12N15-10
【公开号】CN104560951
【申请号】CN201410724663
【发明人】陈兴栋, 叶为民, 吕明, 王笑峰
【申请人】复旦大学泰州健康科学研究院, 复旦大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月3日