高度多样的组合抗体文库的制作方法
【专利说明】高度多样的组合抗体文库
[0001] 发明背景
[0002] 1.发明领域
[0003] 本发明一般涉及获得自骆驼科动物物种的抗体文库，并且更特别地涉及包含对应 于在野生型人抗体中使用的那些链家族之链家族的骆驼科动物抗体文库。
[0004] 2.相关领域描述
[0005] 随着展示方法（例如核糖体展示、噬菌体展示和细胞表面展示）的出现，抗体文 库已经成为用于抗体研宄和开发的越来越重要的资源。抗体文库在设计和构建方式上不 同。最重要的文库是为鉴定和分离治疗性抗体而开发的那些。Ponsel等，"High Affinity， Developability and Functional Size ：The Holy Grail of Combinatorial Antibody Library Generation，" Molecules 2011，16, 3675-3700 提供了概述。
[0006] 自然界利用体细胞高突（somatic hypermutation，SHM)来产生高亲和力抗体。已 经开发出许多亲和力成熟技术来模拟SHM。成熟技术的目标一般是在所选择的中度亲和 力候选者中引入一定程度的多样性，随后在逐渐提高的选择压力下进行重复选择。期望提 供这样的文库，所述文库提供具有高早熟亲和力的抗体。根据Perelson等，可直接从组合 抗体文库获得的亲和力（即，不存在亲和力成熟）一般与文库大小相关（Perelson，A.S.; Oster,G. F. Theoretical studies of clonal selection ：Minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J. Th eor. Biol. 1979,81, 645-670)〇
[0007] 亲和力/文库大小相关性可容易地从概率的角度来理解：文库越大，从其可用的 结构单元（building block)生成高亲和力抗体的概率越大。然而，大小本身并不是答案， 文库的质量至少同样重要。如由 Ponsel 等，"Functional library size·· .matters more than absolute library size. "（Ponsel 等，同上，3676 页）所述。
[0008] 自然界依赖于抗体结构单元（特别是重链（Vh)和轻链（'))的随机组合。人抗体 的生成例如利用7个V h家族和16个V JC族（10个λ家族和6个κ家族），其非常有助 于人抗体的多样性。期望抗体文库将包含大量的抗体家族以便接近自然界中的多样性。
[0009] 由来自健康人供体的抗体构建的原初抗体文库（nalfve antibody library)原则 上包含完整的人抗体链。与免疫文库相比，原初文库不太适于开发高亲和力治疗性抗体。此 夕卜，已经发现原初文库之链多样性的重要部分在标准筛选和富集方案的选择压力下丧失。 [0010]由获得自被感染人类的抗体构建的免疫文库具有产生高亲和力治疗性抗体的潜 力。预期这样的文库可包含完整的人抗体链。然而，被感染的人供体的免疫系统常常严重 受损，导致低质量的免疫文库。事实上，目标治疗性抗体几乎当然地处理特征在于减弱患者 免疫系统的疾病。
[0011] 在许多情况下，不可能通过免疫健康人供体来获得抗原特异性抗体。用危及生命 的或有毒的抗原来免疫在伦理上不可能。其他抗原不触发人类的稳健（robust)免疫应答， 或者根本没有免疫应答。
[0012] 可通过免疫实验动物（例如小鼠或大鼠）来获得抗原特异性抗体。然而，这样的 动物往往是严重近交的，这降低了免疫应答的多样性。此外，鼠抗体与人种系仅共有有限数 量的抗体链家族。
[0013] Dreier等，2011年12月8日的美国专利申请公开号2011/0300140公开了用于通 过免疫骆驼科动物物种（大羊驼（Lama glama))来产生高亲和力抗体的方法。该文献报道 了在家族λ 3、λ5和λ8中νλ链的分离。未报道V κ链。
[0014] Dreier等，2011年7月7日的美国专利申请公开号2011/0165621公开了用于人源 化通过免疫骆驼科动物物种所获得之抗体的方法。该文献提出了以下家族之链的人源化方 案：重链：VH1、VH3 和 VH4 ;νλ 链：νλ 1、νλ2、νλ3、νλ5 和 νλ8 ;以及 Vk 链 Vk 1、Vk 2 和 Vk 4。
[0015] Schofield 等"Application of Phage Display to High Throughput Antibody Generation and Characterization，"Genome Biol. (2007)报道了包含超过 1010种人抗体 的高质量噬菌体展示文库。该出版物提供了多种抗体链的使用频率的概述。VkI和Υλ6 是使用最频繁的轻链。
[0016] 因此，需要来自非人动物的抗体文库，其中呈现大量人抗体链家族。
[0017] 特别需要来自非人动物的抗体文库，其中呈现人抗体链V λ 6。
【发明内容】
[0018] 本发明涉及来源于骆驼科动物物种的抗体文库，所述文库包含属于以下人抗体链 家族中至少之一的抗体链：VH6、V κ 3和V λ 6。优选包含属于人V λ 6家族之抗体链的抗体 文库。
【附图说明】
[0019] 图1是存在于Schofield等，同上的文库中之人链家族的使用频率的图 不° 来源：http ://openi. nlm. nih. gov/detailedresult. php ? img = 2258204_ gb-2007-8-ll-r254-3&query = the&fields = all&favor = none&it = none&sub = non e&uniq = O&sp = none&req = 4&simCollection = 2583049-pone. 0003793. g005&npos = 35&prt = 3〇
[0020] 图2是与人抗体中的重链家族的使用（每对的右手条）相比，本发明的骆驼科动 物抗体文库中的人重链家族使用（每对的左手条）的图示。
[0021] 图3是与人抗体中的K链家族的使用（每对的右手条）相比，本发明的骆驼科动 物抗体文库中的人κ链家族使用（每对的左手条）的图示。
[0022] 图4是与人抗体中的λ链家族的使用（每对的右手条）相比，本发明的骆驼科动 物抗体文库中的人VHl链家族使用（每对的左手条）的图示。
[0023] 图5是与人抗体中的λ链家族的使用（每对的右手条）相比，本发明的骆驼科动 物抗体文库中的人VH3链家族使用（每对的左手条）的图示。
[0024] 图6是与人抗体中的λ链家族的使用（每对的右手条）相比，本发明的骆驼科动 物抗体文库中的人VkI链家族使用（每对的左手条）的图示。
[0025] 图7是与人抗体中的λ链家族的使用（每对的右手条）相比，本发明的骆驼科动 物抗体文库中的人νλ?链家族使用（每对的左手条）的图示。
[0026] 图8示出了 V λ种系6。
[0027] 图9是参照人VH家族和种系基因对应物之每个VH家族（VH1、VH3、VH4、VH5和 VH7)的骆驼科动物VH种系基因的比对。同一性％表示VH种系的每个骆驼（野骆驼（Camel ferus))和大羊蛇（羊蛇（Lama pacos)或骆马（lama vicugna))框架（FR1+FR2+FR3)与参 照FR氨基酸序列（ref，此处为人VH种系对应物）所共有的相同氨基酸（点）的百分比。
[0028] 图10是参照人V λ家族和种系基因对应物之每个V λ家族（V λ 1、V λ 2、V λ 3、 νλ4、νλ5、νλ6、νλ7、νλ8、νλ9和νλ 10)的骆驼科动物νλ种系基因的比对。同一性％ 表示￥1种系的每个骆驼（野骆驼）和大羊驼（羊驼或骆马）框架$1?1+?1?2+?1?3)与参照 FR氨基酸序列（ref，此处为人V λ种系对应物）所共有的相同氨基酸（点）的百分比。
[0029] 图11是骆驼科动物Vk家族与相应的人种系的比对。同一性％表示V κ种系的 每个骆驼（野骆驼）和大羊驼（羊驼或骆马）框架（FR1+FR2+FR3)与参照FR氨基酸序列 (ref，此处为人Vk种系对应物）所共有的相同氨基酸（点）的百分比。
[0030] 图12示出骆驼科动物（羊驼和野骆驼）VH基因和相应的引物。
[0031] 图13示出骆驼科动物（羊驼、野骆驼和大羊驼）V λ基因和相应的引物。
[0032] 图14示出骆驼科动物（羊驼、野骆驼和大羊驼）V κ基因和相应的引物。
[0033] 图15示出VHl引物1与VHlFRl的前23bp之比对的一个实例。该比对的实例说明 了特异于V家族扩增的引物是如何设计的。通过将属于相同家族（此处的一个实例为VHl 家族）之V种系基因的所有框架I(FRl)进行比对来产生V家族特异性引物。从羊驼WGS 和HTG、野骆驼WGS和任何可用的序列数据库或者未公开或公开的文献中收集和注释的所 有已发现的V种系序列提取所有的FRl家族V特异性。WGS表示全基因组鸟枪测序项目并 且HTG或HTGS表示高通量基因组序列。点表示与参照序列（此处在该实例中由VHl-引物 1表示）相比相同的核苷酸。此处VHl-引物1是允许在13位用G或C退火的简并引物； 对于引物合成，S表示G/C。
[0034] 发明详述
[0035] 以下是本发明的详细描述。
[0036] 定义
[0037] "抗体"（Ab)和"免疫球蛋白"（Ig)是糖蛋白，其表现出与（靶）抗原的特异性结 合。已知骆驼科动物物种具有两种不同类型的抗体；经典的或"常规"的抗体还有重链抗体。
[0038] 本文使用的术语"骆驼科动物抗体"是指任何同种型的常规骆驼科动物抗体，包括 IgA、IgG、IgD、IgE或IgM。自然的或天然存在的"常规"骆驼科动物抗体通常是异四聚体糖 蛋白，由两条相同的轻（L)链和两条相同的重（H)链构成。
[0039] 术语"抗体链"与术语"抗体结构域"交换使用，并且是指抗体的重链或轻链。
[0040] 术语"抗体文库"是指用于筛选和/或组合成完整抗体所展示的抗体和/或抗体 片段的集合。抗体和/或抗体片段可在核糖体上、在噬菌体上或在细胞表面（特别是在酵 母细胞表面）上展示。
[0041] 如果人抗体链与该家族的其他成员具有至少80%的序列同源性，则认为人抗体链 属于特异性"抗体链家族"。基于该定义，已经鉴定出23个人抗体链家族：7个重链（V h)家 族；6个V κ轻链家族；以及10个V λ轻链家族。因此，如果人抗体链与V λ 6家族的其他 成员具有至少80%的序列同源性，则认为人抗体链属于人家族V λ 6。已经发现，通常，抗体 链与其他家族的成员具有小于70%的序列同源性。
[0042] 如果骆驼科动物抗体链与该家族的人种系序列具有至少80%的序列同源性，则认 为骆驼科动物抗体链属于特异性人抗体链家族。优选地，序列同源性至少为85 %，更优选为 90 %，仍更优选为至少95 %。
[0