043] 骆驼科动物抗体可获得自骆驼科物种的外周血或特定组织，例如脾。抗体可获得 自正常的健康动物，或者来自于患病的动物。然而，优选地，在用靶抗原主动免疫动物从而 引发针对靶抗原的免疫应答（其中动物产生与靶抗原发生免疫反应的骆驼科动物常规抗 体）之后，从所述动物获得骆驼科动物抗体。在US 2011/0300140中描述了免疫骆驼科动 物的方案，其公开内容通过引用并入本文。
[0044] 过程通常将包括免疫骆驼科（Camilidae)物种的动物（包括但不限于大羊驼和羊 马它（alcapas))。优选地，所述动物属于远交（outbred)种群，这有助于免疫应答的强度和多 样性。主动免疫之后，可从经免疫的动物分离外周血淋巴细胞或活检组织（例如淋巴结或 脾活检组织）。可筛选所收获的淋巴细胞以产生针对靶抗原的常规骆驼科动物抗体。对于 构建原初抗体文库，不进行这样的筛选。
[0045] 可使用编码骆驼科动物VH和VL结构域的核酸（通过主动免疫或通过其他方式获 得的）来制备骆驼科动物文库，例如Fab文库，如在US 2011/0300140中所述。
[0046] 还可构建编码骆驼科动物常规抗体之VH和/或VL结构域的表达载体文库以获得 扩增的基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH和/或VL结构域的核 苷酸序列。构建所述表达载体文库包括以下步骤：
[0047] a)扩增编码骆驼科动物常规抗体之VH和/或VL结构域的核酸分子的区以获得扩 增的基因区段，每个基因区段包含编码骆驼科动物常规抗体之VH结构域的核苷酸序列或 者编码骆驼科动物常规抗体之VL结构域的核苷酸序列；以及
[0048] b)将在a)中获得的基因区段克隆到表达载体中，以使得每个表达载体包含至少 编码VH结构域的基因区段和/或编码VL结构域的基因区段，由此获得表达载体文库。
[0049] 步骤a)可通过任何合适的扩增技术（例如PCR)来进行。在使用PCR的情况下， 重要的是选择适当的引物。使用次优的引物导致失去有价值的多样性，因为属于重要人家 族的抗体链可逃脱分离和检测。例如，以往属于人VH6、V κ 3或V λ 6家族的链已经逃脱分 离和/或检测，原因是使用的引物不适用于属于这些家族的序列。
[0050] 在第一实施方案中，本发明的抗体文库包含属于至少7个，优选至少10个，更优 选至少12个，甚至更优选至少15个人抗体链家族的抗体链。该实施方案利用了抗体文库 的功能大小比绝对大小更重要的发现。考虑具有相等绝对大小（假设10 1°抗体）的两个 抗体文库，A和B。文库A包含仅5个不同家族的抗体链，而文库B包含10个不同家族的 抗体链。可容易地看到文库B在亲和力成熟方案（例如链改组）中提供更多的可能排列 (permutation)。因此，与文库A相比，文库B提供产生高亲和力抗体的更大概率，即使这两 个文库的绝对大小相等。
[0051] 文库多样性同样重要的是更好的表位覆盖，因为更大的多样性提高了能够靶向功 能上和/或治疗上相关的抗原上之表位的可能性。文库多样性同样重要的是提高鉴定具有 期望的第二特性（secondary properties)的抗体分子的概率，所述第二特性例如结合特异 性、与靶抗原直向同源物的交叉反应性、稳定性、易于制备等。
[0052] 该实施方案文库的另一个重要方面是其示出大量的人链家族。鼠抗体文库可以是 高度多样的，因为鼠种系中大量的Vk家族。因此，鼠抗体文库满足功能大小的标准，在此 基础上可预期当针对特异性靶标筛选时这样的文库产生大量的高亲和力抗体。然而，许多 这些"选中物（hit)"是无法使用的，因为其相异于人抗体。其他选中物可能需要这样广泛 的人源化改造以使其丧失其亲和力的大部分。然而，本发明的文库产生需要很少人源化改 造的抗体。
[0053] 已经发现大多数或所有抗体链家族均通过多个独特的基因来表达。例如，V λ 1链 家族至少有五个不同基因。该发现为甚至更大的文库多样性打开了大门。本发明的一个重 要方面是开发允许从大于一个基因的抗体库（pool)提取给定抗体链家族的引物。
[0054] 在第二实施方案中，本发明的抗体文库包含至少一个以下人链家族的抗体链： VH6、V κ 3和V λ 6。该实施方案是基于这样的观察，每个这些家族对于人种系抗体的多样性 是足够重要的以值得努力建立骆驼科动物抗体文库以及开发扩增和分离它们所必需的适 当引物，所述骆驼科动物抗体文库大到足以包含可收获量的这些家族的链。
[0055] 在第三实施方案中，本发明的抗体文库包含至少三个人家族VH3、V κ 1和V λ 6的 成员；优选地，四个人家族VHl、VH3、V κ 1和V λ 6的成员；仍更优选地，五个人家族VHl、 VH3、Vk 1、νλ 1和νλ6的成员；甚至更优选地，六个人家族VH1、VH3、Vk 1、νλ 1、νλ2和 乂入6的成员；最优选地，七个人家族￥!11、￥!13、￥1〇1、￥1〇2、￥入1、￥入2和￥入6的成员。该 实施方案反映了这样的认识，在自然界中，抗体链的这些组合，虽然分别表示1. 5%、3. 1 %、 4. 7%、6. 3%和7. 8%的可能排列，但是其表示约50%至大于80%的人抗体。由此可见，包 含这些链之组合的文库产生有用治疗性抗体的概率很高，即使这样的文库的绝对大小相对 较小。
[0056] 应理解，为上面三个实施方案给出的标准并不相互排斥，并且一个特定文库可满 足两个实施方案以及可能所有三个的标准。例如，包含所有23个人家族之链的文库将一定 满足所有三个实施方案的标准。
[0057] 说明性实施方案/实施例的描述
[0058] 以下是仅以实施例的方式给出的本发明的某些实施方案的描述。
[0059] 实施例1
[0060] 包括引物序列的扩增方案的描述
[0061] 按照Dreier等的美国专利申请公开2011/0300140中所公开的进行了免疫、PBL分 离、RNA提取和cDNA制备。
[0062] 如由de Haard等（JBC 1999)所述，用cDNA作为模板并且使用与可变结构域的 框架I (FRl) (BACK引物）以及恒定结构域的末端（F OR引物）特异性退火的引物通过PCR 来扩增Fab片段。基于从全基因组鸟枪（WGS)数据库（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/ nuccore/ABRROOOOOOOO)、高通量基因组（HTG)数据库以及测序的扩增子所获得的来自骆 驼科动物（羊驼、野骆驼和大羊驼）的种系序列来设计引物的序列。图9至11示出骆驼科 动物VH、V λ和V κ家族与相应的人种系的比对。将这些序列用作模板来设计表1至3中 所述的FRl引物。骆驼科动物种系序列和相应的FRl引物的概述在图12至14中示出。
[0063] 可在一步PCR或两步PCR中进行大羊驼可变结构域的扩增。对于一步PCR，用于扩 增的BACK和FOR引物包含允许将PCR片段克隆到pCB3噬菌粒载体中的限制性位点。对于 两步PCR，用未标记引物（没有限制性位点）来进行第一步PCR。分离和纯化扩增子，然后 用包含限制性位点的引物进行第二步PCR。BACK引物的限制性位点是ApaLI，而FOR引物 的限制性位点是Asc I。VH-CHl的BACK和FOR引物的限制性位点分别是Sfi I和Not I。或 者，可用以限制性位点标记的引物（FOR引物具有AscI位点，而基于FR4的BACK引物具有 BsteII位点）来再扩增DNA区段，并将其克隆为VL片段，由此产生包含与人C区组合的大 羊驼来源之V区的嵌合Fab。反义引物在表4中示出。
[0064] 在50 μ 1反应体积中使用Phusion聚合酶（ThermoFischer)和500pM的各引物将 PCR进行28个循环（在96 °C下1分钟，在60 °C下1分钟以及在72 °C下1分钟）。
[0065] 按照在Dreier等的美国专利申请公开2011/0300140中所述进行Fab文库的构 建。
[0066] 表1.用于骆驼科动物VH基因扩增的FRl引物
【主权项】
1. 抗体文库，其获得自骆驼科动物物种，所述文库包含属于至少七个不同人抗体链家 族的抗体链。
2. 根据权利要求1所述的抗体文库，其包含一个人抗体链家族中由至少两个不同基因 表达的抗体链。
3. 根据权利要求1所述的抗体文库，其获得自大羊驼。
4. 根据权利要求1所述的抗体文库，其包含属于至少十个不同人抗体链家族的抗体 链。
5. 根据权利要求1所述的抗体文库，其包含属于至少十二个不同人抗体链家族的抗体 链。
6. 根据权利要求1所述的抗体文库，其包含属于至少十五个不同人抗体链家族的抗体 链。
7. 根据权利要求1所述的抗体文库，其包含以下人链家族中的至少一种抗体链：VH6、 Vk3和V入6〇
8. 根据权利要求1所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH3、Vk1和V A 6的成员。
9. 根据权利要求8所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vk1和V A 6的成 员。
10. 根据权利要求9所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vk1、V A 1和 V入6的成员。
11. 根据权利要求11所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vk1、V A 1、V入2 和V A 6的成员。
12. 根据权利要求11所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vk1、V A 1、V入2 和V A 6的成员。
13. 根据权利要求12所述的抗体文库，其包含人抗体链家族VH1、VH3、Vk1、Vk2、 V入1、V入2和V入6的成员。
14. 一种用于构建来自骆驼科动物物种之免疫文库的方法，其包括使用具有以下序列 的引物在PCR中扩增Fab片段的步骤：GAGGTGCAGSTGGTGGAGTCTGGG 或 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG。
15. -种用于构建来自骆驼科动物物种之免疫文库的方法，其包括使用具有以下序列 的引物在PCR中扩增Fab片段的步骤：GCTACCCAGRTGACCCAGTCTYCCTCC 或 GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGCC。
16. -种用于构建来自骆驼科动物物种之免疫文库的方法，其包括使用具有以下序列 的引物在PCR中扩增Fab片段的步骤：GAGGTTGTGCTGACTCAGCCCAGCTC。
【专利摘要】本申请公开了获得自骆驼科动物物种的免疫文库，其包含属于至少7个人种系抗体链的抗体链。所述文库中大量人种系抗体链家族的存在有助于所述文库在产生针对人靶抗原之抗体中的有用性。从所述文库产生的抗体具有低固有免疫原性。
【IPC分类】C07K16-00, C07K16-46
【公开号】CN104583236
【申请号】CN201380044638
【发明人】约翰内斯·约斯夫·威廉默斯·德哈德, 克里斯托夫·弗雷德里克·杰罗姆·布朗什托, 亚历克斯·克拉伦比克, 伊克贝尔·阿舒尔, 哈利尔·埃尔马祖阿里, 于尔根·德尔法韦罗
【申请人】阿尔金-X有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年9月2日
【公告号】CA2879834A1, EP2890709A2, US20150166680, WO2014033304A2, WO2014033304A3