核酸样品制备
【专利说明】核酸样品制备 夺叉引用
[0001] 本申请要求2012年4月16日提交的美国临时申请号61/624, 897的权益，该申请 通过引用并入本文。
【背景技术】
[0002] 近年来，在DNA测序领域已取得了指数式的迅速进展。诸如焦磷酸测序、离子半导 体测序和聚合酶克隆测序（polony sequencing)等方法旨在将成本降低至使完整基因组测 序成为常规的程度。预期这将使诸多领域（仅举几个例子）如医学、可再生能源、生物安全 和农业发生变革。然而，用于分离适于测序的DNA的技术未能跟上步伐，并存在将成为限制 因素的威胁。
【发明内容】
[0003] 在一些情况下，本发明满足了对从生物样品中分离核酸的改进方法的需求。本文 提供的某些方面的具体特性包括少于约一小时的总样品制备时间，以及少于约一分钟的操 作时间（hands-on time)。在一些实施方案中，本发明可用于从稀的和/或复杂的流体如血 液或环境样品中分离DNA。在其他方面，本发明可使用少量的起始材料，得到高度纯化的核 酸，并且可用于多路和高通量操作。
[0004] 在一些实施方案中，本文公开了一种从包含细胞的流体中分离核酸的方法，该 方法包括：a.将流体施加到装置上，该装置包含能够产生AC动电场（electrokinetic field)的电极阵列；b.使多个细胞集中在第一 AC动电场区内；c.在第一 AC动电场区内 裂解细胞；以及d.在第二AC动电场区内分离核酸，其中所述流体具有能够使多个细胞集 中在第一 AC动电场区内的电导率。在一些实施方案中，第一 AC动电场区是介电电泳场区 (dielectrophoretic field region)，其中第二AC动电场区是介电电泳场区，或其组合。 在一些实施方案中，第一 AC动电场区是第一介电电泳低场区，且第二AC动电场区是第二 介电电泳高场区，其中所述流体的电导率大于300mS/m。在一些实施方案中，第一 AC动电 场区是第一介电电泳高场区，且第二AC动电场区是第二介电电泳高场区，其中所述流体的 电导率小于300mS/m。在一些实施方案中，核酸集中在第二AC动电场区内。在一些实施方 案中，所述方法进一步包括从阵列和分离的核酸中冲洗残余物质。在一些实施方案中，所述 方法进一步包括残余蛋白质的降解。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从阵列和分 离的核酸中冲洗降解的蛋白质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括收集核酸。在一 些实施方案中，第一 AC动电场区由交流电产生。在一些实施方案中，使用具有1伏至40伏 峰-峰值的电压和/或5Hz至5, 000, 000Hz的频率和5%至50%的占空比的交流电产生第 一 AC动电场区。在一些实施方案中，第二AC动电场区是与第一 AC动电场区不同的电极阵 列区。在一些实施方案中，第二AC动电场区是与第一 AC动电场区相同的电极阵列区。在 一些实施方案中，第二AC动电场区由交流电产生。在一些实施方案中，使用具有1伏至50 伏峰-峰值的电压；和/或5Hz至5, 000, 000Hz的频率，和5%至50%的占空比的交流电产 生第二AC动电场区。在一些实施方案中，使电极选择性地通电以提供第一 AC动电场区，并 在随后或连续地选择性地通电以提供第二AC动电场区。在一些实施方案中，通过向细胞施 加直流电裂解细胞。在一些实施方案中，用于裂解细胞的直流电具有1-500伏的电压；以及 施加一次的或作为多个脉冲施加的0. 01至10秒的持续时间。在一些实施方案中，用于裂 解细胞的直流电是以适于裂解细胞的频率施加的一个直流电脉冲或者多个直流电脉冲。在 一些实施方案中，该脉冲具有0.2至200Hz的频率，且占空比为10-50%。在一些实施方案 中，使用直流电、化学裂解剂、酶裂解剂、热、渗透压、声能或其组合在装置上裂解细胞。在一 些实施方案中，残余物质包含裂解的细胞物质。在一些实施方案中，裂解的细胞物质包含由 多个细胞经裂解释放的残余蛋白质。在一些实施方案中，电极阵列涂覆有水凝胶。在一些 实施方案中，水凝胶包含两层或更多层合成聚合物。在一些实施方案中，水凝胶旋涂于电极 上。在一些实施方案中，水凝胶在旋涂之前具有约〇. 5cP至约5cP的粘度。在一些实施方 案中，水凝胶具有约〇. 1微米至1微米的厚度。在一些实施方案中，水凝胶具有约〇. lS/m 至约1.0S/m的电导率。在一些实施方案中，电极阵列为点配置。在一些实施方案中，点之 间的取向角为约25°至约60°。在一些实施方案中，电极阵列是波浪形或非线性线配置， 其中该配置包含重复单元，该重复单元包含由连接体连接的一对点的形状，其中所述点和 连接体限定电极的边界，其中所述连接体朝着或对着所述一对点之间的中点处向内逐渐变 细，其中所述点的直径为沿重复单元长度的最宽处，其中一组平行的重复单元之间的边缘 到边缘距离是等距的或大致等距的。在一些实施方案中，电极阵列包含相对介电常数为约 2. 0至约4. 0的钝化层。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过聚合酶链反应扩增 分离的核酸。在一些实施方案中，核酸包括DNA、RNA或其任意组合。在一些实施方案中，分 离的核酸包含按质量计小于约80%、小于约70%、小于约60%、小于约50%、小于约40%、 小于约30%、小于约20%、小于约10%、小于约5%或小于约2%的非核酸细胞物质和/或 蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含按质量计大于约99%、大于约98%、大于约 95%、大于约90%、大于约80%、大于约70%、大于约60%、大于约50%、大于约40%、大于 约30%、大于约20%或大于约10%的核酸。在一些实施方案中，所述方法在少于约一小时 内完成。在一些实施方案中，不使用离心。在一些实施方案中，通过化学降解和酶降解中的 一种或多种来降解残余蛋白质。在一些实施方案中，用蛋白酶K降解残余蛋白质。在一些 实施方案中，用酶降解残余蛋白质，所述方法进一步包括在蛋白质降解之后灭活该酶。在一 些实施方案中，通过热（例如，50至95°C持续5-15分钟）灭活该酶。在一些实施方案中， 在单独的或同时进行的步骤中冲洗残余物质和降解的蛋白质。在一些实施方案中，通过以 下步骤收集分离的核酸：（i)关断第二AC动电场区；和（ii)以洗脱剂从阵列上洗脱核酸。 在一些实施方案中，核酸以适于测序的形式进行分离。在一些实施方案中，核酸以适于鸟枪 法测序的片段化形式进行分离。在一些实施方案中，所述包含细胞的流体具有低电导率或 高电导率。在一些实施方案中，所述流体包括体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、食物、饮料、 生长培养基、环境样品、液体、水、克隆细胞或其组合。在一些实施方案中，所述细胞包括克 隆细胞、病原体细胞、细菌细胞、病毒、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞和/或其组合。在一些 实施方案中，所述方法进一步包括对分离的核酸进行测序。在一些实施方案中，通过Sanger 测序、焦磷酸测序、离子半导体测序、聚合酶克隆测序、连接测序、DNA纳米球测序、连接测序 或单分子测序对核酸进行测序。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对DNA进行反应 (例如，片段化、限制性消化、连接）。在一些实施方案中，所述反应在阵列上或阵列附近或 在装置内发生。在一些实施方案中，所述包含细胞的流体包含不超过10, 〇〇〇个细胞。
[0005] 在一些实施方案中，本文公开了一种从包含细胞的流体中分离核酸的方法，该方 法包括：a.将流体施加到装置上，该装置包含能够产生AC动电场的电极阵列；b.使多个细 胞集中在第一 AC动电（例如，介电电泳）场区内；c.在第二AC动电（例如，介电电泳）场 区内分离核酸；以及d.冲洗去细胞，其中所述流体具有能够使多个细胞集中在第一 AC动电 场区内的电导率。在一些实施方案中，第一 AC动电场区是介电电泳场区。在一些实施方案 中，第一 AC动电场区是介电电泳低场区，并且其中所述流体的电导率大于300mS/m。在一 些实施方案中，第二AC动电场区是介电电泳场区。在一些实施方案中，所述方法进一步包 括在步骤（e)之后进行残余蛋白质的降解。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从核 酸中冲洗降解的蛋白质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括收集核酸。在一些实施 方案中，第一 AC动电场区由交流电产生。在一些实施方案中，使用具有1伏至40伏峰-峰 值的电压；和/或5Hz至5, 000, OOOHz的频率，和5%至50%的占空比的交流电产生第一 AC动电场区。在一些实施方案中，第二AC动电场区是与第一 AC动电场区不同的电极阵列 区。在一些实施方案中，第二AC动电场区是与第一 AC动电场区相同的电极阵列区。在一 些实施方案中，第二AC动电场区由交流电产生。在一些实施方案中，第二AC动电场区是介 电电泳高场区。在一些实施方案中，使用具有1伏至50伏峰-峰值的电压；和/或5Hz至 5, 000, OOOHz的频率，和5%至50%的占空比的交流电产生第二AC动电场区。在一些实施 方案中，使电极选择性地通电以提供第一 AC动电场区，并在随后或连续地选择性地通电以 提供第二AC动电场区。在一些实施方案中，电极阵列涂覆有水凝胶。在一些实施方案中， 水凝胶包含两层或更多层合成聚合物。在一些实施方案中，水凝胶旋涂于电极上。在一些 实施方案中，水凝胶在旋涂之前具有约〇. 5cP至约5cP的粘度。在一些实施方案中，水凝胶 具有约0. 1微米至1微米的厚度。在一些实施方案中，水凝胶具有约0. lS/m至约I. OS/m的 电导率。在一些实施方案中，电极阵列为点配置。在一些实施方案中，点之间的取向角为约 25°至约60°。在一些实施方案中，电极阵列是波浪形或非线性线配置，其中该配置包含重 复单元，该重复单元包含由连接体连接的一对点的形状，其中所述点和连接体限定电极的 边界，其中所述连接体朝着或对着所述一对点之间的中点处向内逐渐变细，其中所述点的 直径为沿重复单元长度的最宽处，其中一组平行的重复单元之间的边缘到边缘距离是等距 的或大致等距的。在一些实施方案中，电极阵列包含相对介电常数为约2. 0至约4. 0的钝化 层。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过聚合酶链反应扩增分离的核酸。在一些 实施方案中，核酸包括DNA、RNA或其任意组合。在一些实施方案中，分离的核酸包含按质量 计小于约80%、小于约70%、小于约60%、小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约 20%、小于约10%、小于约5%或小于约2%的非核酸细胞物质和/或蛋白质。在一些实施 方案中，分离的核酸包含按质量计大于约99%、大于约98%、大于约95%、大于约90%、大 于约80%、大于约70%、大于约60%、大于约50%、大于约40%、大于约30%、大于约20% 或大于约10%的核酸。在一些实施方案中，所述方法在少于约一小时内完成。在一些实施 方案中，不使用离心。在一些实施方案中，通过化学降解和酶降解中的一种或多种来降解残 余蛋白质。在一些实施方案中，用蛋白酶K降解残余蛋白质。在一些实施方案中，用酶降解 残余蛋白质，该方法进一步包括在蛋白质降解之后灭活该酶。在一些实施方案中，通过热 (例如，50至95°C持续5-15分钟）灭活该酶。在一些实施方案中，在单独的或同时进行的 步骤中冲洗残余物质和降解的蛋白质。在一些实施方案中，通过以下步骤收集分离的核酸： (i)关断第二AC动电场区；和（ii)以洗脱剂从阵列上洗脱核酸。在一些实施方案中，核酸 以适于测序的形式进行分离。在一些实施方案中，核酸以适于鸟枪法测序的片段化形式进 行分离。在一些实施方案中，所述包含细胞的流体具有低电导率或高电导率。在一些实施 方案中，所述流体包括体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、食物、饮料、生长培养基、环境样品、 液体、水、克隆细胞或其组合。在一些实施方案中，所述细胞包括克隆细胞、病原体细胞、细 菌细胞、病毒、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞和/或其组合。在一些实施方案中，所述方法 进一步包括对分离的核酸进行测序。在一些实施方案中，通过Sanger测序、焦磷酸测序、离 子半导体测序、聚合酶克隆测序、连接测序、DNA纳米球测序、连接测序或单分子测序对核酸 进行测序。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对DNA进行反应（例如，片段化、限制 性消化、连接）。在一些实施方案中，所述反应在阵列上或阵列附近或在装置内发生。在一 些实施方案中，所述包含细胞的流体包含不超过10, 〇〇〇个细胞。
[0006] 在一些实施方案中，本文公开了一种用于从包含细胞的流体中分离核酸的装置， 该装置包括：a.壳体；b.加热器和/或包含蛋白质降解剂的容器；以及c.在壳体内的多个 交流电（AC)电极，该AC电极被配置为选择性地通电以建立AC动电高场区和AC动电低场 区，借此AC动电效应使细胞集中在该装置的低场区内。在一些实施方案中，所述多个电极 被配置为选择性地通电以建立介电电泳高场区和介电电泳低场区。在一些实施方案中，电 极阵列涂覆有水凝胶。在一些实施方案中，水凝胶包含两层或更多层合成聚合物。在一些 实施方案中，水凝胶旋涂于电极上。在一些实施方案中，水凝胶在旋涂之前具有约〇. 5cP至 约5cP的粘度。在一些实施方案中，水凝胶具有约0.1微米至1微米的厚度。在一些实施 方案中，水凝胶具有约〇. lS/m至约I. OS/m的电导率。在一些实施方案中，电极阵列为点配 置。在一些实施方案中，点之间的取向角为约25°至约60°。在一些实施方案中，电极阵 列是波浪形或非线性线配置，其中该配置包含重复单元，该重复单元包含由连接体连接的 一对点的形状，其中所述点和连接体限定电极的边界，其中连接体朝着或对着所述一对点 之间的中点处向内逐渐变细，其中所述点的直径为沿重复单元长度的最宽处，其中一组平 行的重复单元之间的边缘到边缘距离是等距的或大致等距的。在一些实施方案中，电极阵 列包含相对介电常数为约2. 0至约4. 0的钝化层。在一些实施方案中，蛋白质降解剂是蛋 白酶K。在一些实施方案中，所述装置进一步包含含有洗脱剂的第二容器。
[0007] 在一些实施方案中，本文公开了一种用于从包含细胞的流体中分离核酸的系统， 该系统包括：a.包含多个交流电（AC)电极的装置，该AC电极被配置为选择性地通电以建 立AC动电高场区和AC动电低场区，借此AC动电效应使细胞集中在该装置的高场区内，其 中所述配置包含重复单元，该重复单元包含由连接体连接的一对点的形状，其中所述点和 连接体限定电极的边界，其中连接体朝着或对着所述一对点之间的中点处向内逐渐变细， 其中所述点的直径为沿重复单元长度的最宽处，其中一组平行的重复单元之间的边缘到边 缘距离是等距的或大致等距的；以及b.能够通过Sanger测序法或下一代测序法对DNA进 行测序的模块；c.能够控制包含多个AC电极的装置、能够对DNA进行测序的模块或其组合 的软件程序；以及d.包含细胞的流体。在一些实施方案中，所述多个电极被配置为选择性 地通电以建立介电电泳高场区和介电电泳低场区。
[0008] 在一些实施方案中，本文公开了一种装置，该装置包含：a.多个交流电（AC)电极， 该AC电极被配置为选择性地通电以建立AC动电高场区和AC动电低场区，其中电极阵列是 波浪形或非线性线配置，其中该配置包含重复单元，该重复单元包含由连接体连接的一对 点的形状，其中所述点和连接体限定电极的边界，其中连接体朝着或对着所述一对点之间 的中点处向内逐渐变细，其中所述点的直径为沿重复单元长度的最宽处，其中一组平行的 重复单元之间的边缘到边缘距离是等距的或大致等距的；以及b.能够进行热循环和扩增 核酸的模块。在一些实施方案中，所述多个电极被配置为选择性地通电以建立介电电泳高 场区和介电电泳低场区。在一些实施方案中，所述装置能够从包含细胞的流体中分离核酸 并对分离的核酸进行扩增。在一些实施方案中，分离的核酸是DNA或mRNA。在一些实施方 案中，在单个腔室中分离核酸并进行扩增。在一些实施方案中，在单个腔室的多个区中分离 核酸并进行扩增。在一些实施方案中，所述装置进一步包括使用洗脱管、腔室和容器中的至 少一种来进行扩增。在一些实施方案中，核酸的扩增是基于聚合酶链反应（PCR)的。在一 些实施方案中，在包含多个温度区的蛇形微通道中进行核酸的扩增。在一些实施方案中，在 截留于不混溶流体中的水性微滴中进行扩增（即，数字PCR)。在一些实施方案中，热循环 包括对流。在一些实施方案中，所述装置包括接触或靠近电极的表面，其中该表面采用能够 选择性地捕获生物分子的生物配体进行功能化。在一些实施方案中，电极阵列涂覆有水凝 胶。在一些实施方案中，水凝胶包含两层或更多层合成聚合物。在一些实施方案中，水凝胶 旋涂于电极上。在一些实施方案中，水凝胶在旋涂之前具有约〇. 5cP至约5cP的粘度。在 一些实施方案中，水凝胶具有约0. 1微米至1微米的厚度。在一些实施方案中，水凝胶具有 约0. lS/m至约1.0S/m的电导率。在一些实施方案中，电极阵列包含相对介电常数为约2. 0 至约4. 0的钝化层。在一些实施方案中，所述表面通过以下方式选择性地捕获生物分子： a.核酸杂交；b.抗体-抗原相互作用；c.生物素-亲和素相互作用；d.离子或静电相互作 用；或e.它们的任意组合。在一些实施方案中，通过以下方式对所述表面进行功能化以最 小化和/或抑制非特异性结合相互作用：a.聚合物（例如，聚乙二醇PEG) ;b.离子或静电 相互作用；c.表面活性剂；或d.它们的任意组合。在一些实施方案中，所述装置包括定向 为（a)平面并排、(b)垂直面对或（c)水平面对的多个微电极装置。在一些实施方案中，所 述装置包括能够进行Sanger测序的模块。在一些实施方案中，所述能够进行Sanger测序 的模块包括能够进行毛细管电泳的模块、能够进行多色荧光检测的模块或其组合。
[0009] 在一些实施方案中，本文公开了一种装置，该装置包括：a.多个交流电（AC)电极， 该AC电极被配置为选择性地通电以建立AC动电高场区和AC动电低场区，其中电极阵列 是波浪形或非线性线配置，其中该配置包含重复单元，该重复单元包含由连接体连接的一 对点的形状，其中所述点和连接体限定电极的边界，其中连接体朝着或对着所述一对点之 间的中点处向内逐渐变细，其中所述点的直径为沿重复单元长度的最宽处，其中一组平行 的重复单元之间的边缘到边缘距离是等距的或大致等距的；以及b.能够进行测序的模块。 在一些实施方案中，所述多个电极被配置为选择性地通电以建立介电电泳高场区和介电电 泳低场区。在一些实施方案中，所述装置包括接触或靠近电极的表面，其中该表面采用能够 选择性地捕获生物分子的生物配体进行功能化。在一些实施方案中，电极阵列涂覆有水凝 胶。在一些实施方案中，水凝胶包含两层或更多层合成聚合物。在一些实施方案中，水凝胶 旋涂于电极上。在一些实施方案中，水凝胶在旋涂之前具有约〇. 5cP至约5cP的粘度。在 一些实施方案中，水凝胶具有约0. 1微米至1微米的厚度。在一些实施方案中，水凝胶具有 约0. lS/m至约1.0S/m的电导率。在一些实施方案中，电极阵列包含相对介电常数为约2. 0 至约4. 0的钝化层。在一些实施方案中，所述表面通过以下方式选择性地捕获生物分子： a.核酸杂交；b.抗体-抗原相互作用；c.生物素-亲和素相互作用；d.离子或静电相互作 用；或e.它们的任意组合。在一些实施方案中，通过以下方式对所述表面进行功能化以最 小化和/或抑制非特异性结合相互作用：a.聚合物（例如，聚乙二醇PEG) ;b.离子或静电 相互作用；c.表面活性剂；或d.它们的任意组合。在一些实施方案中，所述装置包括定向 为（a)平面并排、(b)垂直面对或（c)水平面对的多个微电极装置。在一些实施方案中，所 述装置包括能够进行下一代测序的模块。在一些实施方案中，所述能够进行下一代测序的 模块能够进行焦磷酸测序、离子半导体测序、聚合酶克隆测序、连接测序、DNA纳米球测序或 单分子测序。
[0010] 在一些实施方案中，本文公开了一种从包含细胞的流体中分离核酸的方法，该方 法包括：a)进行本文公开的方法；b)对核酸或核酸的CDNA型式进行PCR扩增，以生成PCR 产物；c)在第三AC动电区内分离PCR产物；d)对PCR产物进行Sanger链终止反应以生成 核酸的测序产物；以及e)对核酸的测序产物进行电泳分离。在一些实施方案中，第三AC动 电区是介电电泳场区。在一些实施方案中，第三AC动电区是介电电泳高场区。在一些实 施方案中，电极阵列是波浪形或非线性线配置，其中该配置包含重复单元，该重复单元包含 由连接体连接的一对点的形状，其中所述点和连接体限定电极的边界，其中连接体朝着或 对着所述一对点之间的中点处向内逐渐变细，其中所述点的直径为沿重复单元长度的最宽 处，其中一组平行的重复单元之间的边缘到边缘距离是等距的或大致等距的。在一些实施 方案中，对核酸的测序产物进行的电泳分离是毛细管电泳。在一些实施方案中，所述方法进 一步包括使用多色荧光检测来分析核酸的测序产物。在一些实施方案中，所有步骤均在单 个芯片上进行。在一些实施方案中，所述包含细胞的流体包含不超过10, 〇〇〇个细胞。 援引并入
[0011] 本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如 同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入本文。
【附图说明】
[0012] 本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用了本发 明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本发明的特征和优点 的更好的理解，附图中：
[0013] 图1示出了示例性装置的俯视图（A)、仰视图⑶和横断面视图（C)。
[0014] 图2示出了结合有不同量的基因组DNA的电极。
[0015] 图3示出了阵列上的绿色荧光大肠杆菌的分离。小图（A)示出了亮视野图像。小 图⑶示出了电极在DEP启动之前的绿色荧光图像。小图（C)示出了在IXTBE缓冲液中 在10kHz、20Vp-p下1分钟之后，电极上的大肠杆菌。小图（D)示出了在IXTBE缓冲液中 在IMHz、20Vp-p下1分钟之后，电极上的大肠杆菌。
[0016] 图4示出了本发明的