核酸样品制备_5

洗涤。在其他实施方案中，冲洗残余物质的方法与特定的起始材料及其组成相关。在一些 情况下，富含脂质的起始材料需要进行涉及适于溶解脂质的疏水性流体的冲洗程序。
[0133] 在一些实施方案中，所述方法包括降解包括残余蛋白质在内的残余物质。在一些 实施方案中，所述装置或系统能够降解包括残余蛋白质在内的残余物质。例如，通过化学降 解（例如酸水解）和酶降解中的一种或多种来降解蛋白质。在一些实施方案中，酶降解剂 是蛋白酶。在其他实施方案中，蛋白质降解剂是蛋白酶K。降解残余物质的可选步骤在任何 合适的时间、温度等条件下进行。在一些实施方案中，从核酸中冲洗降解的残余物质（包括 降解的蛋白质）。
[0134] 在一些实施方案中，灭活或降解用于降解残余物质的试剂。在一些实施方案中，所 述装置或系统能够降解或灭活用于降解残余物质的试剂。在一些实施方案中，通过热（例 如，50至95°C持续5-15分钟）灭活用于降解残余物质的酶。例如，使用热（典型地，15分 钟，70°C)降解和/或灭活包括蛋白酶（例如，蛋白酶K)在内的酶。在其中用酶来降解残 余蛋白质的一些实施方案中，所述方法进一步包括在蛋白质降解后灭活降解酶（例如，蛋 白酶K)。在一些实施方案中，由所述装置中的加热模块来提供热量（例如，30至95°C的温 度范围）。
[0135] 所述方法的某些步骤的顺序和/或组合可以变化。在一些实施方案中，所述装置 或方法能够以任何顺序或组合执行某些步骤。例如，在一些实施方案中，在单独的或同时进 行的步骤中冲洗残余物质和降解的蛋白质。即，冲洗残余物质，随后降解残余蛋白质，接着 从核酸中冲洗降解的蛋白质。在一些实施方案中，首先降解残余蛋白质，随后在组合的步骤 中从核酸中冲洗残余物质和降解的蛋白质两者。
[0136] 在一些实施方案中，核酸被保留在装置中，并且任选地用于进一步的程序，例如 PCR或其他处理或扩增核酸的程序。在一些实施方案中，所述装置和系统能够执行PCR或其 他任选的程序。在其他实施方案中，从装置中收集和/或洗脱核酸。在一些实施方案中，所 述装置和系统能够允许从该装置或系统中收集和/或洗脱核酸。在一些实施方案中，通过 (i)关断第二介电电泳场区；和（ii)以洗脱剂从阵列中洗脱核酸，来收集分离的核酸。示 例性的洗脱剂包括水、TE、TBE和L-组氨酸缓冲液。 核酸及其产率
[0137] 在一些实施方案中，本文所述的方法、装置或系统任选地用于获得、分离或分开可 由这样的方法、装置或系统获得的任何期望的核酸。通过本文所述的方法、装置和系统分离 的核酸包括DNA (脱氧核糖核酸）、RNA (核糖核酸）及其组合。在一些实施方案中，核酸以 适于对核酸进行测序或进一步处理（包括扩增、连接或克隆）的形式进行分离。
[0138] 在多个实施方案中，分离或分开的核酸是含有核酸的组合物，该组合物不含有至 少99% (按质量计）的其他物质、不含有至少99% (按质量计）的残余细胞物质（例如， 来自得到核酸的裂解的细胞）、不含有至少98% (按质量计）的其他物质、不含有至少98% (按质量计）的残余细胞物质、不含有至少95 % (按质量计）的其他物质、不含有至少95 % (按质量计）的残余细胞物质、不含有至少90 % (按质量计）的其他物质、不含有至少90 % (按质量计）的残余细胞物质、不含有至少80 % (按质量计）的其他物质、不含有至少80 % (按质量计）的残余细胞物质、不含有至少70 % (按质量计）的其他物质、不含有至少70 % (按质量计）的残余细胞物质、不含有至少60 % (按质量计）的其他物质、不含有至少60 % (按质量计）的残余细胞物质、不含有至少50 % (按质量计）的其他物质、不含有至少50 % (按质量计）的残余细胞物质、不含有至少30 % (按质量计）的其他物质、不含有至少30 % (按质量计）的残余细胞物质、不含有至少10 % (按质量计）的其他物质、不含有至少10 % (按质量计）的残余细胞物质、不含有至少5% (按质量计）的其他物质，或者不含有至少 5%(按质量计）的残余细胞物质。
[0139] 在多个实施方案中，核酸具有任何合适的纯度。例如，如果DNA测序程序用具有约 20%的残余细胞物质的核酸样品能够运行，则核酸的分离达到80%是合适的。在一些实施 方案中，分离的核酸包含小于约80%、小于约70%、小于约60%、小于约50%、小于约40%、 小于约30%、小于约20%、小于约10%、小于约5%或小于约2% (按质量计）的非核酸细 胞物质和/或蛋白质。在一些实施方案中，分离的核酸包含大于约99%、大于约98%、大于 约95%、大于约90%、大于约80%、大于约70%、大于约60%、大于约50%、大于约40%、大 于约30%、大于约20%或大于约10% (按质量计）的核酸。
[0140] 核酸以任何合适的形式进行分离，包括未修饰的、衍生化的、片段化的、非片段化 的等形式。在一些实施方案中，核酸以适于测序的形式进行收集。在一些实施方案中，核酸 以适于鸟枪法测序、扩增或其他操作的片段化形式进行收集。可使用含有例如在DNA测序 程序中使用的试剂（例如在合成测序方法中使用的核苷酸）的溶液从装置中收集核酸。
[0141 ] 在一些实施方案中，本文所述的方法得到大致代表起始样品中的核酸的分离的核 酸样品。在一些实施方案中，本文所述的装置和系统能够从样品中分离核酸，所述核酸大致 代表起始样品中的核酸。也就是说，通过所述方法收集的或能够通过所述装置或系统收集 的核酸的群体基本上与流体中的细胞中存在的核酸的群体成比例。在一些实施方案中，该 方面在以下应用中是有利的：其中流体是多种细胞类型的复杂混合物且从业者需要基于核 酸的程序来确定各种细胞类型的相对群体。
[0142] 在一些实施方案中，使用本文所述的方法分离的或能够通过本文所述的装置分离 的核酸是高品质的，和/或适于直接用于下游过程，如DNA测序、核酸扩增如PCR或其他核 酸操作，如连接、克隆或进一步的翻译或转化分析。在一些实施方案中，所收集的核酸包含 至多0.01%的蛋白质。在一些实施方案中，所收集的核酸包含至多0.5%的蛋白质。在一 些实施方案中，所收集的核酸包含至多〇. 1%的蛋白质。在一些实施方案中，所收集的核酸 包含至多1%的蛋白质。在一些实施方案中，所收集的核酸包含至多2%的蛋白质。在一些 实施方案中，所收集的核酸包含至多3%的蛋白质。在一些实施方案中，所收集的核酸包含 至多4%的蛋白质。在一些实施方案中，所收集的核酸包含至多5%的蛋白质。
[0143] 在一些实施方案中，通过本文所述的方法分离的或能够通过本文所述的装置分离 的核酸具有至少〇. 5ng/mL的浓度。在一些实施方案中，通过本文所述的方法分离的或能够 通过本文所述的装置分离的核酸具有至少Ing/mL的浓度。在一些实施方案中，通过本文所 述的方法分离的或能够通过本文所述的装置分离的核酸具有至少5ng/mL的浓度。在一些 实施方案中，通过本文所述的方法分离的或能够通过本文所述的装置分离的核酸具有至少 10ng/mL的浓度。
[0144] 在一些实施方案中，使用本文所述的方法、系统或装置从约5, 000个细胞中分离 约50皮克的核酸。在一些实施方案中，本文所述的方法、系统或装置从约5, 000个细胞中得 到至少10皮克的核酸。在一些实施方案中，本文所述的方法、系统或装置从约5, 000个细 胞中得到至少20皮克的核酸。在一些实施方案中，本文所述的方法、系统或装置从约5, 000 个细胞中得到至少50皮克的核酸。在一些实施方案中，本文所述的方法、系统或装置从约 5, 000个细胞中得到至少75皮克的核酸。在一些实施方案中，本文所述的方法、系统或装置 从约5, 000个细胞中得到至少100皮克的核酸。在一些实施方案中，本文所述的方法、系统 或装置从约5, 000个细胞中得到至少200皮克的核酸。在一些实施方案中，本文所述的方 法、系统或装置从约5, 000个细胞中得到至少300皮克的核酸。在一些实施方案中，本文所 述的方法、系统或装置从约5, 000个细胞中得到至少400皮克的核酸。在一些实施方案中， 本文所述的方法、系统或装置从约5, 000个细胞中得到至少500皮克的核酸。在一些实施 方案中，本文所述的方法、系统或装置从约5, 000个细胞中得到至少1，000皮克的核酸。在 一些实施方案中，本文所述的方法、系统或装置从约5, 000个细胞中得到至少10, 000皮克 的核酸。 分析及应用
[0145] 在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括任选地通过聚合酶链反应（PCR) 扩增分离的核酸。在一些实施方案中，PCR反应在电极阵列上或电极阵列附近或者在装置 内进行。在一些实施方案中，所述装置或系统包括适于热循环的加热器和/或温度控制机 制。
[0146] 任选地使用传统的热循环通过将反应化学分析物置于两个高效热传导元件（例 如，铝或银）之间并利用TEC调节反应温度来进行PCR。另外的设计任选地使用穿过光学透 明材料如玻璃或热聚合物的红外线加热。在一些情况下，设计使用包含遍及基底成网络的 传导性布线的智能聚合物或智能玻璃。该传导性布线允许材料的快速热传导并（通过施加 适当的DC电压）提供了所需的温度变化和梯度以维持有效的PCR反应。在某些情况下，使 用电阻芯片加热器和其他将会快速地并与通过其的电流量成比例地改变温度的电阻元件 来实施加热。
[0147] 在一些实施方案中，与传统的荧光测定法（ccd、pmt、其他光学检测器和滤光器） 结合使用，实时地或以规定的时间间隔来监测扩增倍数。在某些情况下，通过光学检测转换 为AFU(与分析物倍增相关的任意荧光单位）或经由阻抗测量或其他电化学感测转化为电 信号来报告最终扩增倍数的定量。
[0148] 鉴于微电极阵列的小尺寸，任选地将这些元件添加至微电极阵列周围并且将在主 样品处理腔室（在DEP阵列之上）中进行PCR反应，或者任选地将待扩增的分析物经流控 技术输送到流体盒内的另一腔室以实现盒上芯片实验室处理。
[0149] 在一些情况下，使用光传递方案来提供光激发和/或发射和/或扩增倍数的检测。 在某些实施方案中，这包括使用流动池材料（热聚合物，如丙烯酸类（PMMA)、环烯烃聚合物 (COP)、环烯烃共聚物（COC)等）作为光波导以消除使用外部组件的需要。另外，在一些情 况下，将光源-发光二极管-LED、垂直腔面发射激光器-VCSEL和其他照明方案直接整合至 流动池内部或直接构筑在微电极阵列表面上以具有内部控制且供能的光源。微型PMTXCD 或CMOS检测器也可内建于流动池中。这种最小化和小型化使得能够在进行快速信号传送 和检测的同时减少类似传统装置（即，标准台式PCR/QPCR/荧光计）的足迹（footprint) 的紧凑式装置成为可能。 芯片h的扩增
[0150] 在一些情况下，硅微电极阵列能够承受PCR所需的热循环。在一些应用中，由于在 转移步骤中可能损失少量的靶核酸，因此芯片上的PCR是有利的。在本文所述的装置、系 统或方法的某些实施方案中，任选地使用任何一种或多种多重PCR技术，这些技术任选地 包括任何一种或多种下列技术：直接在流动池中进行热循环；将材料移动通过具有不同温 度区的微通道；以及将体积移至可在系统上扩增或转移至PCR仪的PCR管中。在一些情况 下，如果出口包含含有不混溶流体和界面稳定剂（表面活性剂等）的T形接头，则进行微滴 PCR(droplet PCR)。在某些实施方案中，微滴通过任何合适的方法进行热循环。
[0151] 在一些实施方案中，使用等温反应进行扩增，例如，转录介导的扩增、基于核酸序 列的扩增、信号介导的RNA扩增技术、链置换扩增、滚环扩增、环介导的DNA等温扩增、等温 多重置换扩增、解旋酶依赖性扩增、单引物等温扩增或环形解旋酶依赖性扩增。
[0152] 在多个实施方案中，在均相溶液中或作为使用锚定引物的非均相体系进行扩 增。在后者的一些实施方案中，所得到的扩增子直接连接到表面上以便有更高程度的多 重性（multiplex)。在一些实施方案中，使扩增子变性以在电极上或电极附近提供单链产 物。然后任选地进行杂交反应以探询遗传信息，如单核苷酸多态性（SNP)、短串联重复序列 (STR)、突变、插入/缺失、甲基化等。任选地通过平行分析来确定甲基化，其中一个DNA样 品用亚硫酸氢盐处理而一个未进行处理。亚硫酸氢盐对未修饰的C进行脱嘌呤化，从而成 为U。在一些情况下，甲基化的C未受到影响。在一些实施方案中，等位基因特异性碱基延 伸用于报告目标碱基。
[0153] 并非使用特异性相互作用，所述表面任选地采用非特异性部分进行修饰以供捕 获。例如，表面可用聚阳离子（例如，聚赖氨酸）进行修饰以捕获可通过反向偏压（-V)释 放的DNA分子。在一些实施方案中，对表面的修饰在表面上是均匀的或特别地进行图案化 以用于对电极区或非电极区进行功能化。在某些实施方案中，这采用光刻法、电化学活化、 点印（spotting)等来完成。
[0154] 在采用多芯片设计的一些应用中，有利的是使芯片夹层（其中两个装置彼此面对 被隔片隔开）形成流动池。在多个实施方案中，装置顺次或并行运行。对于测序和下一代 测序（NGS)，大小片段化和选择对测序效率和质量具有影响。在一些实施方案中，使用多芯 片设计来缩小所收集的物质的大小范围从而形成带通过滤器。在一些情况下，当前的芯片 几何形状（例如，中心-中心间距为200 μ??的80 μ??直径的电极（80/200))用作500bp截 止过滤器（例如，使用约IOVpp和IOkHz的电压和频率条件）。在这样的情况下，捕获大于 500bp的核酸而不捕获小于500bp的核酸。可替代的电极直径和间距的几何形状具有不同 的截止尺寸，以使芯片的组合提供所需的片段大小。在一些情况下，在相似的条件下，相对 于80/200的几何形状，中心-中心间距为100 μπι的40 μπι直径的电极（40/100)具有更低 的截止阈值，而中心-中心间距为400 μ m的160 μ m直径的电极（160/400)具有更高的截止 阈值。在多个实施方案中，将单芯片或多芯片上的几何形状进行组合以选择特定大小的片 段或颗粒。例如，600bp截止芯片将小于600bp的核酸留在溶液中，然后任选地采用500bp 截止芯片（与600bp芯片相对）再捕获该物质。这使得包含500-600bp的核酸群体留在 溶液中。然后任选地在同一腔室、侧腔室或任何其他配置中扩增该群体。在一些实施方案 中，使用单电极几何形状来完成大小选择，其中，在电极上分离>500bp的核酸，随后进行洗 绦，接着降低ACEK高场强度（改变电压、频率、电导率）以释放<600bp的核酸，从而产生 500-600bp的上清液核酸群体。
[0155] 在一些实施方案中，芯片装置与在底部边缘处的加热器垂直地取向，这形成温度 梯度柱。在某些情况下，底部为变性温度，中部为退火温度，顶部为延伸温度。在一些情况 下，对流持续推动该过程。在一些实施方案中，本文提供了包括特别提供电热流并加速该过 程的电极设计的方法或系统。在一些实施方案中，这样的设计任选地位于同一装置上或在 适当放置的单独的装置上。在一些情况下，在顶部通过翼片或风扇等的主动或被动冷却提 供了陡峭的温度梯度。在一些情况下，本文所述的装置或系统包含或本文所述的方法使用 位于装置上或处于反应腔室内的温度传感器来监测温度，并且这样的传感器任选地用来基 于反馈调节温度。在一些情况下，这样的传感器与具有不同热传递性质的材料耦合，以形成 连续和/或不连续的梯度概貌（profile)。
[0156] 在一些实施方案中，扩增在恒温下进行（即等温扩增）。
[0157] 在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括对如本文所公开地分离的核酸进 行测序。在一些实施方案中，通过Sanger测序或下一代测序（NGS)对核酸进行测序。在一 些实施方案中，下一代测序方法包括但不限于焦磷酸测序、离子半导体测序、聚合酶克隆测 序、连接测序、DNA纳米球测序、连接测序或单分子测序。
[0158] 在一些实施方案中，本文公开的分离的核酸用于Sanger测序。在一些实施方案 中，Sanger测序与核酸分离在同一装置内进行（芯片实验室）。用于样品制备和Sanger测 序结果的芯片实验室工作流程包括以下步骤：a)使用ACE芯片进行样品提取；b)在芯片上 进行靶序列的扩增；c)通过ACE捕获PCR产物；d)进行循环测序以富集靶链；e)捕获富集 的靶链；f)进行Sanger链终止反应；采用芯片上多色荧光检测通过毛细管电泳进行靶序列 的电泳分离。必要时，洗涤核酸，加入试剂，并关断电压。可在具有多个捕获区的单个芯片 上或在单独的芯片和/或反应腔室上进行反应。
[0159] 在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括对核酸进行反应（例如，片段化、 限制性消化、DNA或RNA的连接）。在一些实施方案中，如本文所公开的，所述反应在阵列上 或阵列附近或在装置内发生。 其他分析
[0160] 本文所公开的分离的核酸可进一步在多种分析形式中使用。例如，用核酸探针或 扩增子定址的（addressed)装置可用于斑点印迹或反向斑点印迹分析、碱基堆积单核苷酸 多态性（SNP)分析、具有电子严格性（electronic stringency)的SNP分析或STR分析中。 此外，本文公开的这类装置可用于以下形式中：酶促核酸修饰或蛋白质-核酸相互作用，例 如，采用酶报告的基因表达分析、锚定核酸扩增或其他适于固相形式的核酸修饰，包括限制 性内切核酸酶切割、内切或外切核酸酶切割、小沟结合蛋白质分析、末端转移酶反应、多核 苷酸激酶或磷酸酶反应、连接酶反应、拓扑异构酶反应和其他核酸结合或修饰蛋白质反应。
[0161] 此外，本文公开的装置可用于免疫测定。例如，在一些实施方案中，装置的位置可 与抗原（例如，肽、蛋白质、糖、脂质、蛋白聚糖、糖蛋白等）相关联，以通过夹心测定法、竞争 性测定或其他形式测定体液样品中的抗体。或者，装置的位置可用抗体进行定址，以通过夹 心测定法、竞争性测定或其他测定形式检测样品中的抗原。由于抗体和蛋白质的等电点可 通过实验或PH/电荷计算相当容易地确定，因此可以通过简单地调节缓冲液的pH以使寻址 的或分析物物质带有电荷，来利用装置的电子寻址和电子集中优势。
[0162] 在一些实施方案中，分离的核酸可用于免疫测定型阵列或核酸阵列方面。 示例件比较
[0163] 约IOOng输入大肠杆菌基因组对于传统的手动方法是必要的（例如，假设从DNA 提取纯化中回收率为50% (Epicentre WaterMaster试剂盒声称回收率为约30-60% )，则 Nextera需要50ng输入DNA)。这相当于约2000万个细菌。在本发明的一些实施方案中， 少于10, 000个细菌的输入是足够的（例如，由于芯片是自包含的并且涉及较低的转移，因 此效率较高）。在一些实施方案中，输入减少至少100倍，这对于样品有限的应用如肿瘤活 检可能至关重要。
[0164] 以下表1概括了从大肠杆菌到适于测序的DNA的有关示例性步骤。在一些情况 下，传统方法需要离心、若干温度、洗涤步骤以及众多的转移步骤，这是低效的。与此相反， 如本文所述，在一些实施方案中允许用如下的装置进行相同的步骤，该装置最大限度地减 少移液管转移和对具有不同程度的非特异性结合性质的大的原始（virgin)表面的暴露。 在一些情况下，对该装置进行温度控制，以提供适当的反应条件。在一些情况下，PCR、用于 测序预扩增的循环PCR或完整PCR(端点、实时或数字）在装置外（off-device)或在装置 上（on-device)完成。装置外包括不在装置上而在同一盒组件、经由流体通道或导管的连 接上。此外，在一些情况下，在装置的流动池腔室内、在位于盒上的PCR管中或者通过具有 用于温度循环的热区的流体通道完成PCR扩增。在一些情况下，来自装置的腔室的洗脱液 与旁侧通道组合，该旁侧通道装有非水性可混溶流体例如油和其他微滴稳定剂，以在微滴 中进行扩增。在一些实施方案中，温度循环机制如上所述。
[0165] 在表1中，用于传统处理的起始物质的量是在约Iml水中的2-5X IO7个大肠杆菌 细胞，并且将全部量集中在过滤器上。使用如本文公开的芯片，仅向流动池施加在约50微 升中的IXlO 4个大肠杆菌细胞。这使起始物质少了 3个数量级。 表1:核酸分离方法的比较
【主权项】
1. 一种从包含细胞的流体中分离核酸的方法，该方法包括： a. 将流体施加到装置上，该装置包含能够产生AC动电场的电极阵列； b. 使多个细胞集中在第一 AC动电场区内； c. 在第一 AC动电场区内裂解所述细胞；以及 d. 在第二AC动电场区内分离核酸； 其中所述流体具有能够使多个细胞集中在第一 AC动电场区内的电导率。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一 AC动电场区是介电电泳场区，其中所述 第二AC动电场区是介电电泳场区，或其组合。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一 AC动电场区是第一介电电泳低场 区，并且所述第二AC动电场区是第二介电电泳高场区，其中所述流体的电导率大于300mS/ m〇
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一 AC动电场区是第一介电电泳高场 区，并且所述第二AC动电场区是第二介电电泳高场区，其中所述流体的电导率小于300mS/ m〇
5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸集中在第二AC动电场区内。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述阵列和分 离的核酸中冲洗残余物质。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括残余蛋白质的降
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述阵列和分离的核酸中 冲洗降解的蛋白质。
9. 根据前述权利要求中任