包含来自胎盘生长因子的序列的偶联物及其作为生物材料组成成分和在医药中的应用
【专利说明】包含来自胎盘生长因子的序列的偶联物及其作为生物材料 组成成分和在医药中的应用
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2012年7月3日提交的美国序列号61/667, 630的优先权，据此 其通过提述完整并入。 发明领域
[0003] 所属技术领域，总体而言，涉及通过特异性结合相互作用结合胞外基质 (extracellular matrices)的肽。
【背景技术】
[0004] 胞外基质（ECM)为组织提供结构支撑，并为细胞提供信号传导能力。ECM在发育和 组织修复中起重要作用。
[0005] 发明概述
[0006] 如本申请所报道的，已发现胎盘生长因子（P1GF)显示出对于ECM的特异性结合活 性。P1GF是一种血管生成细胞因子，其存在多种剪接变体。P1GF最初是在胎盘中被鉴定出 来，并提出其控制滋养层的生长及发育。P1GF在早期胚胎发育过程中表达。已显示P1GF 在绒毛滋养层表达，而血管内皮生长因子（VEGF)在绒膜板中的间充质起源的细胞中表达。 P1GF在包括心、肺、甲状腺、骨骼肌以及脂肪组织在内的若干种其他器官中表达。P1GF充 当单核细胞VEGF分泌的有效刺激物，并显著地提高炎症前期趋化因子白介素-1 0、白介 素-8、单核细胞化学引诱物蛋白-1、以及健康受试者外周血单核细胞中VEGF的mRNA水平。 P1GF通过将循环中的定向造血干细胞和巨噬细胞募集到生长中的肿瘤的位点来诱导肿瘤 血管发生（Ribatti D, 2008)。
[0007] -种具体实施方案是经分离的多肽，其包含选自具有0-5个保守取代的SEQID N〇:4,具有0-5个保守取代的SEQIDNO:5,及其亚序列的序列。所述的亚序列可以因显 示出特异结合血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白和血纤蛋白中的一种 或以上而被选择。可以指定解离常数，例如所述多肽与血纤蛋白原的特异结合具有小于约 100nM，或小于约40nM，或小于约25nM的解离常数（KD)。
[0008] -种具体实施方案是生物递送载体（delivery vehicle)，其包含生物试剂和肽的 分子融合物，所述肽包含选自具有0-约15%保守取代的SEQ ID N0:4和具有0-约15%保 守取代的SEQ ID N0:5的序列的至少6个残基的序列或亚序列。如本申请中更加详细解释 地，所述的肽显示出特异性结合下述一种或以上甚或全部胞外基质分子，所述胞外基质分 子选自：血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白、血纤蛋白、胶原、胶原I和 硫酸肝素。事实上，经测试的肽显示出特异结合上述的全部胞外基质分子。生物试剂的示 例选自蛋白质、蛋白质药物、标记、免疫试剂、趋化因子、细胞因子以及细胞粘附肽。本申请 所用的术语细胞因子，包括生长因子和形态发生素。
[0009] -种具体实施方案是包含基质的生物材料，所述的基质包含多肽，所述多肽包含 选自具有0-5个保守取代的SEQ ID N0:4,具有0-5个保守取代的SEQ ID N0:5及其全部 亚序列的序列，所述肽显示特异性结合胞外基质分子。所述基质可以是天然的和合成的、共 价交联的、交联但无共价结合的和无交联的。
[0010] 一种具体实施方案是药物，所述药物包含肽，载体（vehicle)，或含P1GF2(如 P1GF2的结构域）的生物材料。所述药物可以用于，例如药物治疗，制备药物组合物，例如作 为疫苗，用于药物递送，伤口愈合，和组织愈合，例如骨、瘘或溃疡愈合。
[0011] 附图简述
[0012] 图1:P1GF2(P1GF2123_144)中的结构域，强烈地且杂乱地结合ECM蛋白。（a)GF与 ECM蛋白的结合通过ELISA测定。超过0. 1的信号（灰色框）被认为是代表特异性结合。 P1GF2与被测试的全部ECM蛋白强烈结合（灰色柱）。（b)剪接变体P1GF2和P1GF-1 (其不 结合）的蛋白序列比对。P1GF2包含位于C-末端附近的附加的21氨基酸插入（P1GF2123_ 144， 灰色）。（c)使P1GF2123_144在与非-结合模型蛋白GST (GST-P1GF2 123_144)融合的情况下结合 ECM 蛋白。扰乱形式（scrambled version)的 P1GF2123_144(GST-P1GF2sJ 不结合 ECM 蛋白。 在（a)和（c)中，n彡3,平均值土SEM。比对显示P1GF-1的序列（P1GF-1LPAVPPQQWALSAG NGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKI RS⑶RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVPRR(SEQ ID N0:58)与 P1GF2 的序列相比较（LP AVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPV ETANVTMQLLKIRS⑶RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERRRPKRGKRRREKQRPTDCHLC⑶AVPRR, SEQ ID NO:59)。
[0013] 图2:使各种GST-P1GF2123_14$段与纤连蛋白、胶原I、硫酸类肝素和神经毡 蛋白-1结合。（a)GST-PlGF2 123_144片段的设计方案。（b)使GST-P1GF2 123_144片段与 纤连蛋白、胶原I、硫酸类肝素和神经毡蛋白-1结合。所描述的比对包括GST-P1GF2 的片段：RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHLC⑶AVPRR(SEQID N0:60),RRRPKGRGKRRREKQRPTDC HL(SEQ ID N0:61), RRPKGRGKRRREKQRPTD(SEQ ID NO:62), RRRPKGRGKRRREKQ (SEQID NO: 1), GKRRREKQ (SEQ ID NO: 2),以及 RRRPKGRG (SEQ ID NO: 3)。
[0014] 图3:用P1GF2123_144 (黑色框）取代VEGF-A165的肝素结合结构域以生成 VEGF-A121-P1GF2123_ 144(SEQ ID N0:7)。P1GF2123_144与 PDGF-BB 的 C-末端融合以产生 PDGF-BB-P1GF2123_144(SEQ ID N0:9)。含点突变（Cys142至 Ser)的 P1GF2123_144*(灰色框）插 入到 BMP-2 的 C-末端以生成 BMP-2_P1GF2123_144*(SEQID NO: 13)。
[0015] 图4:有两幅子图。（a)通过ELISA测定细胞因子-P1GF2123_ 144@^ECM蛋白（纤连 蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白、胶原I、血纤蛋白原）以及硫酸类肝素的结合。ELISA 板经细胞因子包被，并进一步在升高的浓度（〇.〇2_320nM)下与ECM蛋白一起温育。利用抗 体检测结合的ECM蛋白。使结合曲线拟合非线性回归以获得应用A 45(lnm= Bmax*[浓度]/ (KD+[浓度])的解离常数（KD)。n = 3,平均值土SEM。（b)细胞因子s-P1GF2123_144W保留在 血纤蛋白基质中。血纤蛋白基质在野生型细胞因子（P1GF-1、P1GF2、VEGF-A121、VEGF-A165、 PDGF-BB 和 BMP-2)或经修饰的细胞因子（VEGF-A121-P1GF2123_144、？06?-88呼16?2 123_144或 BMP-2_P1GF2123_144W存在下制备，并进一步在8倍体积的生理缓冲液中温育7天。每天更 换所述的缓冲液，并且每天对累积释放的细胞因子进行定量。野生型P1GF-1、VEGF-A121、 VEGF-A165、PDGF-BB 和 BMP-2 被快速地释放，而 VEGF-A121-P1GF2123_144、PDGF-BB-P1GF2123_ 144 以及BMP-2-P1GF2H彬被隔尚在基质中。
[0016] 图5:在体外，P1GF2123_144-融合的GFs显示与野生型GFs类似的生物活性。 (a) 用 VEGF-A121、VEGF-A165 或 VEGF-A-P1GF2123_144刺激人 ECs，（b)用 PDGF-BB 或 H)GF-BB-P1GF2123_144刺激人间充质干细胞。磷酸化的GF受体（VEGFR-2和roGFR-0)通过 ELISA(n = 3,平均值土SEM)定量。将P1GF2123_144插入到VEGF-A和PDGF-BB中不改变它 们的信号传导。而且，P1GF2 123_144插入到VEGF-A121中，将其活性提高至VEGF-A165的水 平。对于VEGF-A165而言，对受体磷酸化提高的活性最可能时由于使PlGF2 123_144g合于神 经毡蛋白-1造成的，其提高VEGF-A刺激VEGFR-2磷酸化的潜力（Migdal M等，1998 ;Pan Q 等，2007 ;Whitaker GB 等，2001)。Student t_ 检验用于统计比较；*p〈0. 05,林p〈0. 01。 (c)通过BMP-2_P1GF2123_144*在人间充质干细胞中促进ALP活性的能力（诱导成骨细胞分 化）对其进行评估。对在BMP-2或BMP-2_P1GF2 123_144#存在下培养了 14天之后的细胞ALP 进行定量。在经BMP-2或BMP-2_P1GF2123_144JS疗的细胞间没有观察到细胞数量和ALP活 性的差异。结果是以ALP/10k细胞的ng(n = 4,平均值土SEM)表达。
[0017] 图6:P1GF2123_144-融合的GFs展示对ECM组成成分增强的亲和力。（a)野生型相比 于P1GF2 123_144-融合的GFs对ECM蛋白和硫酸类肝素的亲和力（表示为KD)n = 3,平均值 土SEM。（b-f)相对于野生型GFs，P1GF2123_144-融合的GFs在递送位点持续保留一段时间。 (b) 在皮下注射到小鼠背部皮肤时，VEGF-A165和VEGF-A-P1GF2123_144保持（retention)。n =6/时间点，平均值土SEM。（c-f)当置于填充有血纤蛋白基质的、小鼠背部皮肤（c，d) 和小鼠颅盖（e，f)中的5mm直径缺陷时，野生型和P1GF2 123_144-融合的GF保持。在血纤蛋 白基质（灰色柱）和所述缺陷周围的组织中（黑色柱，远于2mm)3和6天后保持。4/ 时间点，平均值土SEM。对于所有的小图，Student' s t-检验；#p〈0. 01，*#p〈0. 001。
[0018] 图 7:VEGF-A-P1GF2123_144和 PDGF-BB-P1GF2 123_144比野生型 VEGF-A 和 TOGF-BB诱导更好的伤口愈合和血管发生。（a-j)递送低剂量VEGF-A-P1GF2123_ 144* H)GF-BB-P1GF2123_14 (各200ng，组合）4促进糖尿病小鼠中的皮肤-伤口愈合，而相同剂量 的野生型VEGF-A165和TOGF-BB没有。表面（topically)递送GFs (在第0,3,和6天， 在第10天分析伤口；在0, 3, 6和9天，在第15天分析伤口）或在血纤蛋白基质中递送一 次，治疗全层背部-皮肤伤口（直径6_)。对6个不同的组进行的试验：表面，仅PBS载 体，VEGF-A165+PDGF-BB,和 VEGF-A-P1GF2123_144+PDGF-BB-P1GF2123_ 144;在血纤蛋白中，仅 血纤蛋白、含 VEGF-A165PDGF-BB 的血纤蛋白和含 VEGF-A-P1GF2123_144+PDGF-BB-P1GF2123_ 144 的血纤蛋白。在10和15天后通过组织学评价（表面组；a-b)，或7和10天后（血纤蛋白 组；f-g)的伤口闭合以及肉芽组织形成。全部的点为平均值土SEM(n = 8-10伤口每组每 时间点。31：11(16111:'8 1：-检验；吨〈0.05，*吨〈0.01，**吨〈0.001。在第10天（(3，11)对血纤蛋 白组，代表性的组织学，第15天对表面组（苏木精和伊红染色）。黑色箭头指示伤口边缘； 红色箭头指示愈合中的上皮舌的尖端。所述肉芽组织，染成粉-紫色。伤口下面的肌肉染 成粉-红色。比例尺（Scale bar) = 1mm。（d，e，i，j)肉定量芽组织中的血管发生。10天 和15天之后（表面组；d，e)，或7天和10天之后（血纤蛋白组；I，J)，针对ECs(⑶31+细 胞）和SMCs(结蛋白+细胞）将伤口组织染色；双重染色指示稳定的血管形态（n多4/时间 点，平均值土 SEM)。利用Student's t-检验比较野生型GFs和P1GF2123_144-融合的GFs ; *p〈0. 05, **p〈0. 01，***p〈0. 001。
[0019] 图8:与相同剂量的野生型VEGF-A165(10yg)相比，VEGF-A-P1GF2123_14^导更少 的血管渗透。（a)该图显示在小鼠耳部皮肤中的血管渗透测定。n多4,平均值土SEM。为 了统计比较，利用非参数Mann-WhitneyU试验将VEGF-A165和VEGF-A-P1GF2 123_144进行比 较；*p〈0. 05。（b，c)应用VEGF-A20min后小鼠耳部皮肤脉管系统的代表性图像。由红色标 记的葡聚糖从脉管中泄露使得VEGF-A诱导的渗透可视化。比例尺=0. 2mm。
[0020] 图 9:与野生型 PDGF-BB 和 BMP-2 相比，递送 PDGF-BB-PlGF2123_14jP BMP-2_P1GF2123_ 144#在大鼠中诱导更多的骨再生。通过表面地或在血纤蛋白基质中递送 GFs治疗临界-大小的（Critical-size)颜盖缺损（直径6mm)。对6个不同的组进行的 试验：表面地，仅盐水载体、BMP-2+PDGF-BB 和 BMP-2-PlGF2123_144*+PDGF-BB-PlGF2123_ 144; 在血纤蛋白中，仅血纤蛋白、含BMP-2+PDGF-BB的血纤蛋白和含BMP-2-PlGF2123_144#+PDGF -BB-P1GF2 123_144的血纤蛋白。剂量为：对表面治疗组，递送至硬脑膜GF各1 yg，组合；对 血纤蛋白组，GF各200ng，组合。（a-d)治疗后4后，通过yCT以骨量和缺损的覆盖范围 (coverage)测定骨修复（a，b显示表面组；c，d显示血纤蛋白组）。（e-j)代表性的颅盖重 建。e，盐水载体；f.BMPj+PDGF-BB^BMPj-PlGFZuH彬+PDGF-BB-PlGF2 123_144;h，仅血纤 蛋白，i，带有