及先天性和适应性免疫应答发挥功能必不可少的调节蛋白（Rossi D and Zlotnik A，2000;Vilcek J and Feldmann M，2004)。就其定义而言，除诸如迀移和分化之类的其他 细胞应答之外，生长因子能诱导细胞生长（Cross M and Dexter TM, 1991)。生长因子可以 是形态发生素或细胞因子。
[0040]例如，参与组织形态发生的关键细胞因子包括血管内皮生长因子（VEGFs)、血小 板衍生的生长因子（PDGFs)、成纤维细胞生长因子（FGFs)、胰岛素-样生长因子（IGFs)、 骨形态发生蛋白（BMPs)、转化生长因子0 (TGF-0S)和神经营养素（0-NGF，NT-3，BDNF)。 许多细胞因子结合胞外基质组成成分，如硫酸类肝素蛋白多糖（Lindahl U and Li JP，2009)，并驻留在那里直至通过酶促过程或解离释放。当被释放时，也有当基质-结合时 (Makarenkova HP等，2009)，这些因子结合于细胞表面受体并触发信号传导，主要是通过激 酶活化。由此，所述胞外基质作为信号分子（黏附分子和细胞因子）的储藏库（reservoir) 指示细胞决策过程。血管发生，多细胞形态发生以及干细胞分化是由胞外基质和细胞因子 严格控制的细胞过程，尤其是通过它们的协同信号传导进行控制。由于组织修复由这些过 程驱动，胞外基质的功能引导组织工程化和再生医学中的生物材料设计，总体目标是模拟 下述关键特征：黏附分子的呈递以及细胞因子释放。
[0041] 疫苗学
[0042] 如上所述，细胞因子在组织形态发生中起着基础性的作用。通过调节不同免疫细 胞类型的增殖、成熟和迀移，由此驱动针对不同类型抗原的合适的免疫应答，细胞因子在免 疫学中也起着基础性的作用。在免疫学中，细胞因子TGF-0是尤其重要的细胞因子。
[0043] 趋化因子是小的蛋白质，其也在免疫学中起着基础性的作用。在趋化因子中，干扰 素-Y (IFN-Y)是针对病毒和细菌抗原的先天性和适应性免疫，以及肿瘤控制的决定性免 疫调节趋化因子。IFN-Y主要由天然杀伤（NK)以及天然杀伤T-细胞（NKT)表达，作为先天 性免疫应答的一部分，在适应性免疫应答中通过⑶4和⑶8T细胞表达。IFN- y是调节Thl 和Th2平衡中最重要的趋化因子：Thl细胞表达IFN-Y，其反过来引起Thl分化和Th2分化 抑制。对IFN-y的不同细胞应答是通过其结合到异源二聚体受体（IFNGR1和IFNGR2)激 活的，所述异源二聚体受体激活JAK/STAT1信号途径。这一细胞内信号传导活化触发多种 下游基因的表达，其中包括趋化因子干扰素Y-诱导的蛋白l〇(CXCL10)和趋化因子（C-X-X 基序）配体11 (CXCL11)。这两种趋化因子通过结合细胞表面的CXCR3受体发挥它们的作 用，并被认为分别是单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、NK和T-细胞的有效化学引诱物。
[0044] 在疫苗学中，抗原是肽或蛋白质结构域，或病原体或自身来源的完整蛋白质 (Hubbell JA等，2009)。在感染性疾病中的疫苗抗原基于在所关注的病原体中发现的蛋白 质，如流感抗原或结核病抗原。在感染性疾病中靶定的抗原，无论是预防性的还是治疗性疫 苗，不计其数。癌症中的疫苗抗原是基于在肿瘤细胞类型中发现的蛋白质，如将在许多肿瘤 类型中高度表达的抗原存活蛋白，或在黑色素细胞中表达的抗原TRP-2,以及用于黑素瘤中 癌症接种疫苗的靶。在癌症中靶定的抗原数量不计其数。
[0045] 可制备包含P1GF2结构域和抗原（例如本申请所述的载体或基质）的疫苗。P1FG2 提供附着于天然组织或基质中的ECM。疫苗组合物可包含佐剂，危险信号和/或趋化因子， 其可能是基质、包含P1GF2结构域的分子融合物的一部分，或是在P1GF2之外加入的。
[0046] P1GF
[0047] 本申请描述了模拟来自P1GF2的结构域的肽。细胞因子P1GF存在多种同种型。 P1GF2是P1GF-1的加长的同种型，在人中包含插入序列RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL(SEQ ID NO:4)，在小鼠中包含RRKTKGKRKRSRNSQTEEPHP(SEQ ID NO:5)，在其他哺乳动物中包含其他 相关序列。本申请报道了出人意料的发现，即，这种肽与血纤蛋白原和血纤蛋白，以及胞外 基质蛋白纤连蛋白、玻连蛋白、骨桥蛋白、生腱蛋白C非常强烈地结合，并以稍弱的程度结 合胶原I。这一结构域称作P1GF2123_144。术语P1GF2用于指这一结构域和展示出特异性结 合胞外基质的亚结构域。P1GF2123_144和血纤蛋白原/血纤蛋白之间的强烈结合可用于结合 血纤蛋白基质中的包含P1GF2 123_14^蛋白质，包括蛋白质药物和抗原。P1GF2123_14#血纤蛋 白原/血纤蛋白和/或胞外基质之间的强烈结合可用于，使得下述蛋白质的存在延长，所述 蛋白质为包含已施用于血纤蛋白基质中的P1GF2 123_14J9蛋白质、包含已施用到损伤位点上 或之中的P1GF2123_ 14J9蛋白质、或包含已施用到组织位点上或之中的P1GF2123_144的蛋白质。 P1GF2结构域和胞外基质蛋白之间的强烈结合可用于延长包含P1GF2结构域的蛋白质在组 织中的保持，其借助所述蛋白质结合于内源性地存在于组织中或组织损伤位点的胞外基质 实现。所发现的P1GF2 123_144和血纤蛋白原/血纤蛋白之间的亲和力，以及存在于P1GF2 123_144 和胞外基质分子之间的亲和力促成了多个优选的具体实施方案。
[0048] 术语P1GF2或P1GF2结构域包括SEQ ID N0:4和5的肽，及其亚序列，以及这些序 列的变体。SEQ ID N0:4和5是P1GF2结构域的具体实施方案。另外的P1GF2结构域的具 体实施方案包括所述序列的保守取代，以及N-末端和/或C-末端残基被截短的截短形式。 通过阅读本申请，本领域技术人员能够容易地实现对所述截短的鉴定。提供特异性结合的 保守残基的数量在约4到约15个残基之间，更长的序列也显示特异性结合。因此，P1GF2 的具体实施方案包括包含选自具有0-5个保守取代的SEQ ID N0:4,具有0-5个保守取代 的SEQ ID NO:5,及其亚序列的序列的经分离的多肽，所述的亚序列表现出与血纤蛋白原、 纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白和血纤蛋白中的一种或以上的特异结合活性。所 述的亚序列包括4到15个残基长的全部亚序列，例如所有的4, 5, 6和7个残基的亚序列， 以及所有7-12和5-15个残基的亚序列。所述序列的解离常数值低，例如所述多肽与血纤 蛋白原的特异性结合具有小于约40nM的解离常数（KD)。此外，通常可以实现用D-氨基酸 取代所发现的序列中的L-氨基酸，如Giordano中所述。
[0049] 参照图2,子图a，测试P1GF2123_152的亚序列的数据显示7个残基的片段保留有对 胞外基质（ECM)的特异结合活性。但是，更大的片段显示出更高的亲和力。这一数据指示 可以合理地预期更短的序列也可以显示出与合适的ECM的特异性结合，包括全部4个以上 残基的亚序列。此外，在生物领域中已知有许多序列当其是更大的分子的一部分的时候是 有效力的，例如RGD细胞黏着基序。尽管一些分子将以扰乱此类相对小的序列的特异性结 合的方式折叠，本领域技术人员非常熟悉那些用于创建以有效的方式应用此类序列的甚或 非常大的分子的技术。另一方面，考虑到存在有大量的天然生物分子而仅有约20种天然氨 基酸，作为随机概率的结果，存在一定量可能具有一个和以上此类序列的天然生物分子。这 样的序列不应被认为就特异性结合而言是活性的，因为这样的生物分子已进化调整为完成 特定的功能。结合于ECM是非常重要的天然发生的特异性功能，没有具体情况下合适生物 学证据时其不应被归因于特定生物分子。
[0050] 大多数的黏附结合基序可进行一些保守取代同时保持其功能性。尽管并非所有的 此类取代都是有效的，此类改变通常有效。有通常可以对氨基酸序列实施、不改变其活性的 多种保守变化。这些改变称作保守取代或突变；也就是说，属于具有特定大小或特征的一组 氨基酸中的一种氨基酸可被另一种氨基酸取代。氨基酸序列的取代物可选自所述氨基酸所 属类别中的其他成员。例如非极性的（疏水）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸。所述极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺。所述带正电荷的（碱性）氨基酸包括 精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这些 改变基本上不会影响通过丙烯酰胺凝胶电泳或等电点确定的表观分子量。保守取代还包括 将序列的旋光异构体置换为另一种旋光异构体，特别是将序列中的一个或以上的残基由L 氨基酸置换为D氨基酸。此外，对序列中的所有氨基酸均可进行由D氨基酸到L氨基酸的 置换。示例性的保守取代但不限于，Lys取代Arg，反之亦然，以保持正电荷；Glu取代Asp， 反之亦然，以保持负电荷；Ser取代Thr以保持游离-OH ;和Gin取代Asn以保持游离NH2。 此外，有时也可以进行多肽序列和相应的核酸序列中的点突变，缺失和插入，而不丧失多肽 或核酸片段的功能。取代，可以包括例如1，2, 3或更多个残基。本申请中描述的氨基酸残 基或使用单字母氨基酸代号或使用三字母缩写。本申请所使用的缩写与标准的多肽命名一 致，J. Biol. Chem.，（1969)，243, 3552-3559。所有的氨基酸残基序列均以由左到右的方向表 示，即按照常规的由氨基末端到羧基末端的方向。因此，本申请中所示的肽的保守取代可以 定量的方式描述，例如1-5,或百分比，例如0%-33%。本领域技术人员容易理解，所有所 述明确提及的界线内的范围和数值均包括在内，约5%，7约％，或约15%。对于7个残基 中有一个取代的情况，所述取代为14. 2%，也即约15%。对于22个残基中2个取代的情 况，所述百分比为9. 1，也即约10%。
[0051] -些具体实施方案提供多种多肽序列和/或经纯化的或经分离的多肽。术语多肽 指氨基酸残基链，无关乎翻译后修饰（例如磷酸化或糖基化）和/或与另外的多肽复合，与 核酸和/或碳水化合物或其他分子一起合成到多亚基复合物中。本申请中蛋白聚糖也称作 多肽。本申请中所用的〃功能性多肽"是能促进所指示的功能的多肽。可通过多种方法生 产多肽，许多方法是本领域所公知的。例如，多肽可通过提取（例如从经分离的细胞）获 得、通过编码所述多肽的重组核酸表达获得或通过化学合成获得。多肽可通过，例如重组 技术，将编码所述多肽的表达载体引入用于表达所述多肽的宿主细胞（例如通过转化或转 染）来生产。
[0052] 有些情况下，需要确定某种肽与本申请中的序列的同一性百分数。在此种情况下， 就所述肽或所述肽的部分的残基数量测定同一性百分数，例如，具有90%同一性的肽有可 能是较大的肽的一部分。
[0053] 本申请所用的术语，纯化的，在用于多肽时指某种多肽经化学合成因此基本上不 被其他多肽污染，或已经和与其天然地伴随存在的大多数细胞成分（如其他的细胞蛋白， 多核苷酸或细胞成分）相分离并纯化的。经纯化的多肽的一个示例是，已与至少70% (以 干重计）的蛋白质以及与其天然伴随出现的有机分子相分离。因此，经纯化的肽的制备物 可以是所述多肽的，例如至少80%，至少90%或至少99% (以干重计）。所述多肽可被工 程化以包含标签序列（如聚组氨酸标签，myc标签，或,FLAG'V标签），以有利于多肽的纯化 和标记（如捕获到亲和基质上，在显微镜下可见）。由此，除非另有说明，经纯化的组合物， 其包含的多肽指经纯化的多肽。术语经分离的指示本发明的多肽或核酸非处于它们的天然 环境之下。因此，本发明的经分离的产物可包含于培养物上清中，可以是部分富集的，由异 源来源生产的，克隆于载体中或与载体配制在一起，等等。
[0054] 多肽可以包括化学修饰；在本申请的背景下，该术语指氨基酸天然存在的化学结 构的变化。此类修饰可对侧链或末端实施，例如改变氨基末端或羧基末端。在一些具体实施 方案中，所述修饰用于创建化学基团，其便于使所述多肽与其他材料相连，或附加治疗剂。
[0055] 特异性结合，如该术语在生物领域所常用的，指所述分子以比非靶组织相对高的 亲合性与靶结合，通常包括多种非共价相互作用，如静电相互作用，范德瓦尔斯（van der Waals)相互作用以及氢键等。特异性结合相互作用表征抗体-抗原结合，酶-底物结合，以 及特异性结合蛋白-受体相互作用；有时此类分子可能结合它们的靶之外的组织，此种结 合称作缺乏特异性，不是特异性结合。
[0056] 讨论
[0057] 实施例1 (参见图1)描述了确定发现P1GF2内的结构域P1GF2123_144强烈且杂乱地 结合ECM蛋白的结果。这一结构域仅是P1GF2的一部分，因此并不存在于自然界中。P1GF2 与所有经测试的ECM蛋白强烈结合（图1，灰色柱）。剪接变体P1GF2和P1GF-1 (其不 结合）的蛋白序列比对图示说明P1GF2如何包含位于近C-末端的额外21个氨基酸插入 (P1GF2123_ 144，灰色）。在P1GF2结构域与蛋白质GST(GST-P1GF2123_144)融合时仍显示有效地 结合。由实施例1可以得出结论P1GF2 123_144包含ECM蛋白结合结构域。测试了多种PLGF2 片段与多种ECM蛋白、硫酸类肝素以及神经毡蛋白-1的结合，结果描述于图2中。实施例 2详细描述了所述实验，以及对所述序列进行截短和/或取代的示例。
[0058] 应用多种细胞因子与P1GF2结构域一起制备融合蛋白（实施例3 ;图3)。图4(参 见实施例4)示出所述融合蛋白与ECM结合的结果。测定了所述特异性结合的解离常数，确 定了 P1GF2对多种ECM蛋白的亲和力被赋予到所述融合物分子。它们包括血管内皮生长因 子（VEGF)、血小板-衍生的生长因子（PDGF)和骨形态发生蛋白（BMP)。实施例5详细描述 了进一步生产细胞因子-P1GF2结构域分子融合物，包括与胰岛素生长因子-I (IGF-I)、转 化生长因子M (TGF-M)、TGF-0 2(TGF-0 2)、脑衍生神经营养因子（BDNF)和神经营养素 (NT)NT-3的融合物。观察到这些生物因子（实施例6,图5)在与P1GF2结构域融合时保持 了其生物活性。事实上，VEGF融合物分子具有提高的活性。
[0059] 在将VEGF-A转移用于临床用途中出现了重要的问题。实际上，尽管VEGF-受体 2 (VEGF-R2)的VEGF-A活化是可能有效地促进血管发生的方法，实际施用VEGF-A却迅速地 诱导血管渗透，其导致全身性低血压和浮肿；这一现象已属于外周和心-血管应用中的剂 量限制性毒性反应（Simons M and Ware JA,