玉米组织特异性启动子及其在提高作物种子品质中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及启动子，尤其涉及从玉米（Zeamays)中分离的组织特异性启动子，本 发明还涉及含有该组织特异性启动子的重组植物表达载体以及重组宿主细胞，本发明进一 步涉及它们在提高作物种子品质、改良作物性状、培育植物新品种等方面的应用，属于植物 组织特异性启动子的分离及应用领域。
【背景技术】
[0002] 启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是重要的顺式作用元件，一般 位于结构基因5'端上游区。高等植物基因调控主要在转录水平进行，启动子控制着基因表 达的起始时间和表达程度，同时对所使用的RNA聚合酶类型也起着决定性作用，所以启动 子是理解基因表达模式和转录调控机制的关键，是植物基因转录调控的中心。
[0003] 根据启动子的转录模式及功能，可将其分为三类：组成型启动子、组织或器官 特异性启动子和诱导型启动子。目前，在植物基因工程中使用的大多数为组成型启动 子，使外源目的基因在植物各组织部位高水平表达，但是，组成型启动子也有诸多缺点， 例如，不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达，过度消耗细胞内的物质和能 量（GittinsJR，PellnyTK，HilesER，RosaC，BiricoltiS，etal. (2000)Transgene expressiondrivenbyheterologousribulose-l, 5-bisphosphatecarboxylase/ oxygenasesmall-subunitgenepromotersinthevegetativetissuesofapple(Malus pumilamill.).Planta210:232-240.);大量异源蛋白或代谢产物在植物体内积累，打破 植物的代谢平衡，不利于植物生长（RobinsonDJ(1996)Environmentalriskassessment ofreleasesoftransgenicplantscontainingvirus-derivedinserts.Transgenic research5:359-362.);容易引起基因沉默或共抑制现象（KumpatlaSP，Chandrasekharan MB,IyerLM,GuofuL,HallTC(1998)Genomeintruderscanningandmodulationsystems andtransgenesilencing.TrendsinPlantScience3:97-104；MetteMF,Aufsatz ff,vanderffindenJ,MatzkeMA,MatzkeAJ(2000)Transcriptionalsilencingand promotermethylationtriggeredbydouble-strandedRNA.EMBOJ19:5194-5201.)。因 此，科学家们不断寻找更为有效的组织或器官特异性启动子来代替组成型启动子，以期更 精确的调控外源基因的表达。
[0004] 组织或器官特异性启动子调控下的基因转录过程一般只发生在某些特定的组织 或者器官中。组织或器官特异性表达启动子可以更加经济有效的调控外源基因的表达，特 异地在特定需要的部位发挥作用，这样不仅可以提高外源基因的表达丰度，而且将生物能 耗降到最低，从而不影响植株的正常生长。
[0005] 玉米（Zeamays)是中国最大的粮食作物，也是重要的转基因作物。玉米组织特异 性启动子可分为根、茎、叶、花、胚、胚乳、果实、木质部、绿色组织等组织或器官特异性启动 子，每一类型的组织特异性启动子都具有一些特殊的功能元件。从玉米中分离获得组织特 异性启动子，可以利用特异性启动子将目的基因在植物中进行特异性的高效表达，这对玉 米进行分子改良或生产具有特殊用途的新玉米品种等方面有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明目的之一是提供从玉米（Zeamays)中分离的组织特异性启动子。
[0007] 本发明目的之二是提供含有上述组织特异性启动子的重组表达载体以及含有该 重组表达载体的重组宿主细胞。
[0008] 本发明目的之三是将所述的组织特异性启动子以及含有该组织特异性启动子的 重组表达载体应用于提高作物种子品质、改良作物性状、培育植物新品种等方面。
[0009] 为实现上述目的，本发明首先提供了一种从玉米（Zeamays)中分离的全长组织特 异性启动子（P2941)，其多核苷酸序列为（a)、（b)、（c)或（d)所示：
[0010] (a)、SEQIDNO. 1所示的多核苷酸序列；或
[0011] (b)、与SEQIDNO. 1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸仍具有组织特异性启动子的功能；或
[0012] (C)、与SEQIDNO. 1的多核苷酸序列至少有60%以上同源性的多核苷酸序列，且 该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能；优选的，其与SEQIDNO. 1的多核苷酸序列至少 有80%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能；更优选 的，其与SEQIDNO. 1的多核苷酸序列至少有90%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核 苷酸具有组织特异性启动子的功能；最优选的，其与SEQIDNO. 1的多核苷酸序列至少有 95%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能；或
[0013] (d)、在SEQIDNO. 1的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多 核苷酸变体，该多核苷酸变体包含SEQIDNO. 2序列，且该多核苷酸变体仍具有组织特异性 启动子的功能。
[0014] 本发明进一步将SEQIDNO. 1所示的多核苷酸序列从5'端逐渐删除部分序列得到 多个截短的序列，将截短后的各个序列分别连接到带有报告基因的表达载体上验证截短后 的序列是否具有组织特异启动子的功能；本发明通过功能验证实验确定，将SEQIDNO. 1的 5'端核苷酸序列截短后的SEQIDNO. 2所示的192bp的序列（为-192 -+1之间的片段） 能够驱动报告基因在玉米种子胚中进行特异性的表达，说明SEQIDNO. 2所示的192bp的 序列仍具有组织特异性启动子的功能。
[0015] 本发明进一步将SEQIDNO. 1所示启动子从5'端开始逐渐删除得到两个截短的 启动子片段P2941_Q和P2941_7，其长度分别为 〇. 4kb(SEQIDNO. 3)和 0. 16kb(SEQIDNO. 4); 根据稳定转化玉米试验结果可见，启动子缺失片段P2941<(SEQIDNO. 3)仍具有在胚组织中 启动报告基因表达的功能，但其活性较全长启动子（SEQIDNO. 1)明显下降，说明启动子缺 失片段P2941KI(SEQIDNO. 3)是一个启动子活性降低的胚组织特异性启动子；启动子缺失片 段P2941_7(SEQIDNO. 4)仍具有在胚组织中启动报告基因表达的功能，但其活性较全长启动 子己941(5￡〇IDN0.1)明显下降，说明启动子缺失片段P2941_7(SEQIDN0.4)也是一个启动 子活性明显降低的胚组织特异性启动子，但是在机械损伤诱导下在营养组织表现出诱导表 达的特性。
[0016] 因此，本发明提供了一种将SEQIDNO. 1所示的全长组织特异启动子截短后的组 织特异性启动子，其多核苷酸序列为（a)、（b)、（c)或（d)所示：
[0017] (a)、SEQIDNO. 2所示的多核苷酸序列；或
[0018](b)、与SEQ ID NO. 2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多 核苷酸仍具有组织特异性启动子的功能；或
[0019](c)、与SEQIDNO. 2的多核苷酸序列至少有60%以上同源性的多