结合irf5的细胞穿透肽的制作方法

结合irf5的细胞穿透肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明包括结合干扰素调节因子5 (IRF5)和破坏IRF5同源二聚化和/或减弱下 游信号传导的细胞穿透肽，和用于筛选所述抑制IRF5的肽的方法。
【背景技术】
[0002] IRF5是调节自体免疫病因学的关键成分，包括系统性红斑狼疮（SLE)和IL6和 IL12的下游调控的推定治疗靶标。多种全基因组关联研宄（GWAS)报道了 IRF5多态性与 增加的SLE风险相关，与现有的临床前文献一起提供了令人信服的理由证实阻断IRF5功能 可能有益于 SLE 患者（Agarwal ;Cunninghame 等人；Demirci 等人；Dieud6 和 Dawidowicz) 〇 在临床前文献中提出的数据对IRF5在调节自体免疫性疾病病因的关键成分中的重要作 用提供了重要的线索。然而，靶向IRF5的特异工具的缺乏限制了使用针对IRF5的SiRNA 或使用IRF5基因敲除小鼠的早期革巴标评价努力（Beal ;Feng等人；Kozyrev和Alarcon ; Krausgruber 等人；Lien 等人）。
[0003] 此外，阻断IRF5功能将影响在表达IRF5的SLE相关细胞类型（单核细胞、巨噬 细胞、浆细胞样树突细胞和B细胞）中的Toll样受体7/8/9的信号传导。因此，靶向IRF5 可以通过减弱去调控的信号传导，如导致由PDC产生干扰素、由单核细胞/巨噬细胞产生 IL-12, IL6和TNF α、以及由B细胞产生自身抗体的TLR7/8/9信号传导，显著有益于SLE或 其他自体免疫性疾病的患者，在这些疾病中IRF5信号传导起显著的作用。
[0004] 细胞穿透肽（CPP)是一类具有以相对无毒的方式运送多种否则不通透的大分子 跨越细胞质膜能力的肽。CPP肽通常5至约30个氨基酸（aa)长，具有阳离子、两性、或疏水 性质。细胞穿透肽著名的例子包括Tat、穿透素（Penetratin)和运输蛋白（Transportan) (Fawell，S.等人 Proc. Natl. Acad. Sci. 1994，第 664-668 页；Theodore, L.等人 J. Neurosci. 1995,第 7158-7167 页；Pooga, M.等人 FASEB J. 1998,第 67-77 页）。细胞穿 透肽如Tat可以附着至效应肽，或者效应肽可以固有地是细胞穿透的。固有地是细胞穿透 的效应肽的实例包括 Arf (1-22)和 p28 等等（Johansson, H. J.等人Mol. Ther. 2007, 16(1)， 第 115-123 页；Taylor, B. N.等人 Cancer Res. 2009, 69 (2)，第 537-546 页）。
[0005] 为了正确地剖析IRF5的作用，并抑制靶标二聚化，所谓的工具分子（小分子或肽） 是必要的。虽然IRF5的晶体结构是已知的（Chen等人），但是缺乏既靶向IRF5又抑制同源 二聚化，从而调节IRF5功能的特异工具（小分子或肽）。
[0006] 本发明着重在新的细胞穿透肽，其设计成既达到靶标、又抑制对二聚体形成（调 节核易位及功能的关键步骤）重要的残基。由于缺乏生化地评估这些细胞穿透肽的直接方 法和其它靶向IRF5二聚化的工具分子，建立了新的基于FRET的生化测定法。在本专利中 描述的生化测定法鉴定了抑制IRF5二聚化的工具。
[0007] 因此，本发明一般地涉及肽，其是细胞穿透的，并具有与IRF5结合和破坏IRF5同 源二聚化和/或减弱下游信号传导的能力，本发明还涉及测试、筛选和评估肽的方法，特别 是结合和/或抑制IRF5的细胞穿透肽。
【附图说明】
[0008] 图1 :该图描述了示范性的本发明FRET二聚体测定法的原理和验证。图IA提供了 实施例12中详细描述的生化IRF5FRET二聚体测定法的示意图。图IB和IC用来验证生化 测定法的用途。在这些实验中，生物素标签IRF5蛋白（200nM)与等体积递增量的6-His(以 下称His)标签IRF5蛋白混合。横坐标代表his标记的IRF5的浓度，纵坐标代表发生的 TR-FRET测量值。已经在文献中表明（Royer等人，2010) S430的磷酸化促进IRF5的二聚 化。S430D突变体被认为是磷酸模拟物（phosphomimetic)。在图IB中，Kd(yM)表明二聚 化的次序为S430D :S430D〈S430D :野生型〈野生型：野生型，这些观察结果与文献报道值一 致。图IC示出了 S430D+R353D突变体的TR_FRET信号显著降低，也与IRF5二聚化的预期 行为符合。
[0009] 图2 :此图示出结合IRF5的本发明的标记肽。图2A提供了实施例13中详细描述 的直接生化结合FRET测定法的示意图（FITC CPP结合到IRF5(222-425))。在这些实验中， 本发明标记的细胞穿透肽，具体地，经FITC标记的形式的SEQ ID NOS 13-14和4-7(100nM) (SEQ ID NOS 16-21)与递增浓度的N末端His (6组氨酸）-标记的IRF5 (222-425) SEQ ID NO :22混合。以下图2B和2C中横坐标代表his标记的IRF5 (222-425,缺少螺旋5,并且不 能同源二聚化）的浓度（μ M)，纵坐标表示在经FITC标记的形式的SEQ ID NOS 13-14和 4-7 (SEQ ID NOS 16-21)存在下，TR-FRET的测定值。Kd表明所有六种FITC形式的SEQ ID NOS 13-14和4-7 (SEQ ID NOS 16-21)直接结合所测试的IRF5蛋白。设计为不结合IRF5 的对照经FITC标记的CPP (SEQ ID NO :23)不显示任何亲合力。
[0010] 图3 :此图表示在HeLa细胞中孵育2小时（h)(图3A)和24小时（h)(图3B)后， 经 FITC 标记的 CPP' s (CPP 是 SEQ ID NO :13-14 和 4-7, FITC-标记的形式的 SEQ ID NOS 13-14和4-7是SEQ ID NOS 16-21)的定位，并由此确认测试的CPP是细胞穿透的。所使用 的方案详细描述在实施例14。简言之，HeLa细胞用10 μ M或3 μ M浓度的FITC标记的CPP 处理2小时和24小时时间点（分别为图A和图Β)。在40χ放大下获得图像。
[0011] 图4 :该图示出了与对照（V)相比SEQ ID NOS 13-14和4-7减弱在THP-I (人单 核细胞系）中IL-6的生产。如实施例15所述，THP-I细胞用50 μ M的这些CPP' s (SEQ ID NO :13-14和4-7)预处理30分钟，并用10μΜ R848(TLR7/8激动剂）ο/η刺激。横坐标表示 处理条件，纵坐标表示归一化至载体（没有肽但用10 μ M R848刺激）的产生的IL6量和如 通过细胞滴度glo测定的细胞数。SEQ ID NO :13-14和4-7都减弱R848刺激的IL6生产。
[0012] 图5A-5F :这_图示出了 SEQ ID NO 13-14和4-7以浓度依赖的方式减弱R848诱 导的人外周血单核细胞（PMBC)中的IL-12生产。如实施例16所述，用SEQ ID NO 13-14和 4-7预处理从健康人类志愿者中分离的PBMC 30分钟，并用1 μ M R848 (TLR7/8激动剂）o/n 刺激。横坐标表示使用的化合物浓度，纵坐标表示IL12的量。SEQ ID NO 13-14和4-7都 以浓度依赖的方式减弱R848刺激的PBMC的IL-12生产。效力的次序为SEQ ID NO :14〈SEQ ID NO ：4<SEQ ID NO ：6<SEQ ID NO ：5<SEQ ID NO ：7<SEQ ID NO ：13〇
[0013]
[0014] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域 的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在实践或测试本发明时可以使用类似或等同于 本文描述的方法和材料，如下描述了合适的方法和材料。
[0015] 除非另有说明，在本申请中使用的命名法是基于IUPAC系统命名法。
[0016] 除非另外指出，本文提及的所有肽序列都根据常规惯例写入，由此N末端氨基酸 在左边和C-末端氨基酸在右边。两个氨基酸残基之间的短线表示肽键。当氨基酸具有异 构体形式时，除非另有明确指示，其是所表示氨基酸的L型。
[0017] 术语"氨基酸"是指通式Nh2CHRCOOH的有机化合物，其中R可以是任何有机基团。 具体地，术语氨基酸可以指天然和非天然（人造）氨基酸。为方便描述本发明，使用对于多 种氨基酸残基的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员所熟知的，但为了清楚在 下面列出：
[0018] ASP = D =天冬氨酸；Ala = A =丙氨酸；Arg = R =精氨酸；Asn = N =天冬酰 胺；Gly = G =甘氨酸；Glu = E =谷氨酸；Gln = Q =谷氨酰胺；His = H =组氨酸；Ile = I =异亮氨酸；Leu = L =亮氨酸；Lys = K =赖氨酸；Met = M =甲硫氨酸；Nle =正亮氨 酸；Phe = F =苯丙氨酸；Pro = P =脯氨酸；Ser = S =丝氨酸；Thr = T =苏氨酸；Trp = W =色氨酸；Tyr = Y =酪氨酸；和Val = V =缴氨酸。
[0019] 术语"氨基酸基序"是指氨基酸的保守序列（例如? ---L--V)。该序列还可以包 括空隙，以指示分隔基序的每个氨基酸的残基的数目。
[0020] 本发明的细胞穿透肽（CPP)表示约5至约30个氨基酸的肽，没有通过连接两个或 以上非天然氨基酸而形成的桥或环状肽的形式的构象限制（即，其不是"订书肽（stapled p印tide) "），并且其能够穿透细胞膜（例如使不同物质易位进入细胞）。
[0021] 短语"结合IRF5的肽"或"能够结合IRF5的肽"表示在靶标是IRF5的生化测定 法中是阳性的（在本文中定义为IC 50〈75uM)那些肽的组。
[0022] 术语"IRF5"（干扰素调节因子5)表示蛋白质，其通常包含如下的氨基酸序列
[0023] MNQSIPVAPTPPRRVRLKPWLVAQVNSCQYPGLQWVNGEKKLFCIPWRHATRHGPSQD⑶NTIFKAWAK ETGKYTEGVDEADPAKWKANLRCALNKSRDFRLIYDGPRDMPPQPYKIYEVCSNGPAPTDSQPPEDYSFGAGEEEEE EEELQRMLPSLSLTEDVKWPPTLQPPTLRPPTLQPPTLQPPVVLGPPAPDPSPLAPPPGNPAGFRELLSEVLEPGPL PASLPPAGEQLLPDLLISPHMLPLTDLEIKFQYRGRPPRALTISNPHGCRLFYSQLEATQEQVELFGPISLEQVRFP SPEDIPSDKQRFYTNQLLDVLDRGLILQLQGQDLYAIRLCQCKVFffSGPCASAHDSCPNPIQREVKTKLFSLEHFLN ELILFQKGQTNTPPPFEIFFCFGEEWPDRKPREKKLITVQVVPVAARLLLEMFSGELSWSADSIRLQISNPDLKDRM VEQFKELHHIWQSQQRLQPVAQAPPGAGLGVGQGPWPMHPAGMQ(同种型 1，SEQ ID N0:11)。备选地， IRF5表示至少包括同种型2、3或4的其他同种型。
[0024] 术语"可药用的盐"是指不是生物学或其它方面不期望的盐。可药用的盐包括酸 和碱加成盐。
[0025] 术语"可药用的酸加成盐"表示与无机酸（如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，碳酸，磷 酸），和选自脂肪族，环脂族，芳族，araliphatic，杂环，羧酸的有机酸，和有机酸的磺酸类 (如甲酸，乙酸，丙酸，乙醇酸，葡糖酸，乳酸，丙酮酸，草酸，苹果酸，马来酸，丙二酸，琥珀酸， 富马酸，酒石酸，柠檬酸，天冬氨酸，抗坏血酸，谷氨酸，邻氨基苯甲酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃 酸，扑酸，苯乙酸，甲磺酸，乙磺酸，对甲苯磺酸和水杨酸）形成的那些可药用的盐。
[0026] 术语"可药用的碱加成盐"是指与有机碱或无机碱形成的那些可药用的碱。可用 的无机碱的实例包括钠，钾，铵，钙，镁，铁，锌，铜，锰和铝盐。从可药用的有机无毒碱衍生的 盐包括伯，仲和叔胺的盐，取代的胺包括天然存在的取代胺的盐，环胺和碱离子交换树脂如 异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、trimethamine、二环 己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、 甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶和聚胺树脂的盐。
[0027] 术语"药物组合物"和"药物制剂"（或"制剂"）可互换使用，表示这样形式的制剂， 其形式允许包含在其中的活性成分的生物学活性是有效的，并且其不含有对施用该药物组 合物的对象有不可接受的毒性的另外成分。
[0028] "液体组合物"是指在大气压下、在至少约2至约8°C的温度下是水性或液体的组 合物。
[0029] 术语"冻干"是指通过升华和/或蒸发至不支持生物或化学反应的水平来冷冻物 质并然后降低水浓度的方法。
[0030] 术语"冻干的组合物"（或"冻干组合物（lyocomposition) "）表示通过液体组合 物的冻干方法获得的或可获得的组合物。通常其是具有小于5%的水含量的固体组合物。
[0031] 术语"重构的组合物"是指表示与重构介质组合的冻干的组合物，所述重构介质促 进了冻干的组合物的溶解。重构介质的例子包括，但不限于，注射用水（WFI)、抑菌性注射用 水（BWFI)、氯化钠溶液（例如0· 9% (w/v)NaCl)、葡萄糖溶液（如5%葡萄糖）、包括表面活 性剂（例如〇· 01 %聚山梨醇酯20)的溶液或pH-缓冲液（如磷酸盐缓冲液）。
[0032] 术语"无菌的"是指具有被微生物污染的概率小于10e-6的组合物或赋形剂。
[0033] 术语"可药用的"是指在制备药物组合物中有用的物质的属性，所述物质通常是安 全，无毒的，并且不是生物学上或其它方面不期望的，并且对兽医以及人类药物用途是可以 接受的。
[0034] 术语"可药用的赋形剂"，"可药用的载体"和"治疗上惰性的赋形剂"可以互换使 用，其指药物组合物中不具有治疗活性并且对施用的对象是无毒的任何可药用的成分，如 在配制药物产品中使用的崩解剂，粘合剂，填料，溶剂，缓冲剂，张力剂，稳定剂，抗氧化剂， 表面活性剂，载体，稀释剂或润滑剂。
[0035] 术语"半数最大抑制浓度"（IC50)是指在体外获得抑制50%生物过程所需的 特定化合物或分子的浓度。IC50值可对数转换为pIC 50值（-log IC50)，其中数值越 高指数地表示效力更大。IC50值不是绝对值，而是取决于实验条件如使用的浓度。使用 Cheng-Prusoff 方程（Biochem. Pharmacol. (1973)22 :3099) IC50 值可以被转换为绝对抑制 常数（Ki)。
[0036] "自体免疫性疾病"是指从个体自身组织产生并且针对个体自身组织的非恶性疾 病或病症。自体免疫性疾病在本文中明确排除恶性或癌性疾病或病症，特别是不包括B细 胞淋巴瘤，急性淋巴细胞白血病（ALL)，慢性淋巴细胞白血病（CLL)，毛状细胞白血病和慢 性成髓细胞白血病。自体免疫性疾病或病症的实例包括，但不限于，炎性反应，如包括银肩 病和皮炎（例如特应性皮炎）的炎症性皮肤病；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠疾病（如 克罗恩氏病和溃疡性结肠炎）相关的反应；呼吸窘迫综合征（包括成人呼吸窘迫综合症； ARDS);皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；变应性病症如湿瘆和哮喘，和 涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的其它病症；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿性 关节炎；系统性红斑狼疮（SLE)(包括但不限于狼疮肾炎，皮肤狼疮）；糖尿病（例如I型 糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病）；多发性硬化症；雷诺氏综合征；自体免疫性甲状腺炎；桥 本氏甲状腺炎；过敏性脑脊髓炎；干燥综合征；青少年发病型糖尿病；和与急性和迟发性超 敏反应相关的免疫反应，其由通常出现在结核病、结节病、多发性肌炎、肉芽肿和血管炎中 的细胞因子和T淋巴细胞介导；恶性贫血（阿狄森氏病）；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神 经系统（CNS)炎性病症；多器官损伤综合征；溶血性贫血（包括但不限于冷沉球蛋白血症 (cryoglobinemia)或库姆斯阳性贫血）；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾 小球基底膜病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；Graves'病；Lambert-Eaton肌无力综合征； 大疱性类天疱疮；天疱疮；自体免疫性多发性内分泌疾病；Reiter氏病；僵人综合征；白塞 氏病；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA