用于肝样本的分类和局灶性结节不典型增生、肝细胞腺瘤和肝细胞癌的诊断的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肝疾病、其分类和诊断的技术领域。本发明提供了一种新方法，该方法 使用用参照样本校准的算法、根据体外基因表达谱的确定和表达谱的分析，用于分类非肝 细胞样本间的肝样本；进一步分类为亚组G1至G6之一的肝细胞癌（HCC)样本；局灶性结节 不典型增生（FNH)样本；进一步分类为HNF1A突变的HCA、炎性HCA、0连环蛋白突变的HCA 或其它HCA样本的肝细胞腺瘤（HCA)样本；和其它良性肝样本。本发明还提供了用于分类 肝样本的试剂盒，以及根据对受试者肝样本的初步分类治疗所述受试者中肝疾病的方法。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌（HCC)代表全球范围癌症引起死亡的首要原因之一（El Serag H NEJM 2011)。尽管广泛使用成像/非侵入性标准诊断肝硬化发展的HCC，即使病理学专家而言， HCC和其它肝肿瘤的鉴别诊断仍然很困难（国际用药评议小组（international consensus group) 2009)。在这种背景下，再生和不典型增生的大结节、胆管癌或其它组织来源的转 移癌组成了典型的陷阱（Forner A Lancet 2012)。此外，非侵袭性标准还没有被证实用 于诊断非肝硬化发展的HCC，这样的HCC占西方国家病例的10%，而在东方国家超过20 % (Forner A Hepatology 2008)。在这种背景下，肿瘤活检是强制性，以及鉴别诊断良性肝肿 瘤（局灶性结节性增生、FNH和肝细胞腺瘤、HCA)可能是具有挑战性的，尤其在分化非常好 的 HCC 和 HCA 之间的鉴别（Bioulac-Sage P，sem liv dis 2011)。
[0003] 此外，HCA组成良性肝肿瘤的异质组，而且最近发现其基因型/表型的分类与预后 相关（Zucman Rossi J Hepatology 2006 ;Van aalten SM J hepatol 2011)。描述了四组 HCA (HNF1A突变、连环蛋白突变、炎性和未分类肝细胞腺瘤），具有激活连环蛋白的突 变的HCA与HCC中增加的恶性转化风险相关。
[0004] 因此，良性和恶性肝细胞肿瘤包括由特定表型和分子特征定义的各种肿瘤的亚 组，这导致了诊断陷阱和评估其预后的困难。
[0005] 因此，需要新的工具，以帮助临床医生和病理学家在临床实践中可靠地区分可能 存在于肝样本的各种类型的组织（是否是肝细胞；如果是肝细胞，是良性或恶性；如果是良 性肝细胞，是局灶结节增生、肝细胞腺瘤、或二者均不是；如果是肝细胞腺瘤，其类型），因 此能够可靠地分类来自疑似患有肝肿瘤的受试者的肝样本。
[0006] 实际上，根据肝样本分类，以及从而根据最终诊断，患者将被给予不同的处理：
[0007] -如果是良性局灶性结节增生（FNH)，建议放弃治疗，不需要随访；
[0008]-如果是良性肝细胞腺瘤（HCA)，通常的治疗包括手术切除或放弃治疗，随访。最 佳治疗的选择还可以取决于HCA更精确的分类成HNF1A突变的、炎性的和0连环蛋白突变 的HCA。例如，如果样本被诊断为小于5cm的HNF1A突变的HCA，可能仅仅随访，即影像/临 床随访是特别有用的，因为出血和恶变的风险低。如果样本被诊断为大小大于5cm的HNF1A 突变的HCA，手术切除治疗可能是特别有用的，因为出血的风险。如果样本被诊断为大小小 于5cm的炎性HCA，仅仅随访，即影像/临床随访可能是特别有用的，因为出血和恶变的风险 低。如果样本被诊断为大小大于5cm的炎性HCA，则手术切除治疗可能是特别有用的，因为 出血的风险。如果样本被诊断为0连环蛋白突变的HCA，无论大小，手术切除的治愈性治疗 可能是特别有用的，因为恶性转化的风险高。
[0009]-如果是肝细胞癌（HCC)，第一次治疗通常包括肿瘤手术切除，但如果肿瘤手术切 除是不可能的，可使用替代治疗。此外，各种辅助疗法可能在肿瘤手术切除后进行。这样的 辅助疗法包括细胞毒性化疗（特别是阿霉素，或者，吉西他滨和奥沙利铂的联合）和/或靶 向治疗（特别是索拉非尼）。最好的治疗策略（包括使用或不使用辅助疗法）的选择可取决 于更精确的HCC类型（见W02007/063118A1中所描述的HCC分类成亚组G1至G6之一）和 /或取决于患者的预后。特别是，如果预后不良，一般给予辅助疗法，然而，如果预后良好，则 不按部就班地使用辅助疗法。此外，如果肝样本进一步分类为HCC亚组G1，则用IGFR1抑制 剂治疗可能是特别有用的，因为胰岛素生长因子途径的活化。如果肝样本被进一步分类为 HCC亚组G1或G2,则用Akt/mtor抑制剂治疗可能是特别有用的，因为对akt/mtor途径的 激活。如果肝样本已被进一步分类为HCC亚组G3,则用蛋白酶抑制剂治疗可能是特别有用 的，因为细胞/周期基因失调。如果肝样本被进一步分类为HCC亚组G5或G6,则用Wnt抑 制剂治疗可能是特别有用的，因为Wnt/连环蛋白途径的活化。
[0010] 在这种背景下，基于受试者肝样本的分子谱的简单的分类/诊断工具将是非常有 益的。
[0011] 几个基因已经被关联到肝样本的分类或特定肝疾病的诊断。例如，在Odom 等人-2004中描述了在肝细胞和非肝细胞组织中差异表达的基因。已在Llovet等 人-2006, Capurro 等人-2003, Chuma 等人-2003, Tsunedomi 等人-2005 和 Kondoh 等 人-1999中鉴定了与良性或恶性肝肿瘤相关的基因。已经在Rebouissou等人-2008和 Paradis等人-2003中公开了局灶性结节增生（FNH)中差异表达的基因。在Rebouissou 等人-2007和Bioulac Sage等人-2007中公开了 HNF1A突变的HCA中差异表达的基 因。在13〇}^1111:等人-2007，13;[01113。3386等人-2007,03(10代1:等人-2002，￥311^1]1〇1:〇等 人-2005, Benhamouche等人-2006，和Rebouissou等人-2008中已经描述了与0连环蛋 白突变相关的基因。在Rebouissou等人-2009和Bioulac Sage等人-2007中公开了炎性 HCA中差异表达的基因。
[0012] 然而，在现有技术中没有公开真正允许简单且可靠地分类各种类型肝脏疾病中肝 样本的方法，以及简单且可靠地诊断肝脏中非肝癌组织的存在、恶性肝细胞癌（HCC)、良性 局灶性结节增生（FNH)、肝细胞腺瘤及其亚型的方法。
[0013] 基于从各种类型肝样本获得的微阵列和定量PCR数据分析的一个新的策略，本发 明人构建了一种简单且可靠的分子算法用于精确分类和诊断肝样本。特别是，本发明人已 建立了几个标签，其能够：
[0014] ?可靠地区分肝细胞和非肝细胞样本（其它组织起源的转移，胆管癌）或者区分良 性和恶性（肝细胞癌）肝细胞样本；
[0015] ?精确诊断存在局灶性结节增生（FNH)或肝细胞腺瘤（HCA)的良性肝癌样本；和
[0016] ?精确诊断HCA样本中的HCA样本类型：HNF1A突变的HCA、炎性HCA、0连环蛋白 突变的HCA或其它HCA。
[0017] 55个基因的一整组允许可靠地分类肝样本的所有那些类型之间的肝脏。
【发明内容】
[0018] 因此，本发明涉及一种用于在体外分类作为非肝细胞样本、肝细胞癌（HCC)样本、 局灶性结节不典型增生（FNH)样本、肝细胞腺瘤（HCA)样本或其它良性肝样本的肝样本的 方法，所述方法包括：
[0019] a)在体外确定来自所述肝样本的包括或由以下38个基因组成的表达谱：EPCAM， HNF4A，CYP3A7, FABP1，HAL，AFP，GNMT，TFRC，C8A，CAP2, LCAT，ANGPT2, AURKA，CDC20, DHRS2， LYVE1， ADM， ANGPTL7, GLUL， ANGPT1， HMGB3, GMNN， RAMP3, RHBG， UGT2B7, LGR5, RARRES2， RBM47, GIMAP5, AKR1B10, GLS2, KRT19, ESR1，SDS，MERTK，EPHA1，CCL5 和 CYP2C9,和任选地 一个或多个内部对照基因，或其等效表达谱；
[0020] b)根据对包含或由以下9个基因组成的表达谱测得的表达水平：EPCAM，HNF4A，C YP3A7, FABP1，HAL, AFP, GNMT，TFRC和C8A，和任选地一个或多个内部对照基因，或其等效表 达谱，使用至少一种用至少一个参照肝样本校准的算法，确定所述肝样本是肝细胞或是非 肝细胞样本；
[0021] c)如果所述肝样本是肝细胞样本，则根据对包含或由以下9个基因组成的表达谱 测得的表达水平：AFP, CAP2, LCAT, ANGPT2, AURKA, CDC20, DHRS2, LYVE1 和 ADM，和任选地一 个或多个内部对照基因，或其等效表达谱，使用至少一种用至少一个参照肝样本校准的算 法，确定所述肝细胞样本是HCC样本或是良性肝细胞样本；
[0022] d)如果所述肝样本是良性肝细胞样本，则根据对包含或由以下13个基因组成的 表达谱测得的表达水平：HAL, ANGPTL7, GLUL, ANGPT1, HMGB3, GMNN, RAMP3, RHBG, UGT2B7, LGR 5, RARRES2, RBM47和GIMAP5,和任选地一个或多个内部对照基因，或其等效表达谱，使用至 少一种用至少一个参照肝样本校准的算法，确定所述良性肝细胞样本是否是FNH样本；
[0023] e)如果所述肝样本是良性肝细胞样本，则根据对包含或由以下13个基因组成的 表达谱测得的表达水平：HAL, CYP3A7, LCAT, LYVE1, AKR1B10, GLS2, KRT19, ESR1, SDS, MERTK ，EPHA1，CCL5和CYP2C9