漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因JsPRP1及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学W及基因工程相关技术研究领域，特别是具有抗真菌活性 的濛潰大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因及应用。
【背景技术】
[0002] 植物在整个生长期内都有可能遭受病原菌的侵染。在种数繁多的植物病害中，真 菌病害约占植物病害的70~80%。兴起于20世纪初期的经典遗传学使人们能够通过杂交育 种成功地培育出抗病新品种，从而大幅度地提高粮食产量。然而，常规育种具有周期长、费 时费力、有利变异少等缺点，不能从根本上解决植物病害难题。近年来，随着分子生物学理 论和技术的不断发展，使人们不但能够从分子水平上深入认识植物与病原物相互作用的机 审IJ，而且还可W通过基因工程快速和高效地培育抗病作物新品种。
[0003] 植物细胞明显区别于动物细胞的特征之一就是具有细胞壁。植物细胞壁是一个高 度复杂和动态的结构，它们决定细胞的大小和形状，在增强植物细胞的机械强度、调控细胞 的生长速度、物质运输、细胞间信息传递等方面起着非常重要的作用。此外，植物细胞壁还 构成了阻止病原体入侵的第一道结构屏障。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、果胶和蛋 白质组成。蛋白质占细胞壁干重的10%左右。细胞壁蛋白质主要由结构蛋白和酶蛋白组成， 结构蛋白被认为形成一个独立的决定壁结构的网络进而辅助细胞壁装配，该些蛋白质在结 构上高度重复，富含特定的一两种氨基酸（许文亮，黄耿青，王秀兰，汪虹，李学宝. 一类新的编码PRPs基因的分离及其在棉花纤维等组织细胞中的表达.生物化学与生物物 理进展.2007，34: 509 - 517.)。
[0004] 富含脯氨酸蛋白（proline-richprotein,PRP)是一类富含脯氨酸和哲脯氨酸 的细胞壁结构蛋白，它们最先发现于胡萝h贬藏根中，被认为是外界伤害的诱导产物（化en J,VarnerJE.IsolationandcharacterizationofcDNAclonesforcarrotextensin andaproline-rich33-kDaprotein.ProceedingsoftheNationalAcademyof Sciences. 1985,82: 4399 - 4403.)。植物富含脯氨酸蛋白可W分为=类：杂合的富含脯氨 酸蛋白化yPRPs)，包含P0VEKP0VXK重复序列的PRPsW及NHyPRP蛋白化uangG,GongS, XuW,LiP,ZhangD,QinL,LiW,LiX.GhHyPRP4,acottongeneencodingputative hybridproline-richprotein,ispreferentiallyexpressedinleavesandinvolved inplantresponsetocoldstress.ActabiochimicaetbiophysicaSinica. 2011, 43: 519 - 527. )〇
[0005]PRPs的表达具有组织器官特异性，并受发育阶段及环境因素的调节。Wyatt等 在大豆中发现了 3个编码PRPs的基因：况巧?/义况巧?/巧日况巧p/y，尽管在核巧酸和氨基 酸序列上显示很高的同源性，但它们的表达特性具有较大差异。5'/，化判在大豆下胚轴的 初皮部和木质部表达，在下胚轴成熟区和伸长区的表皮细胞中也有表达；5&巧?巧在下胚轴 维管组织的皮层细胞中和成熟种子的内珠被中表达；巧?巧在下胚轴快速伸长区中柱的 内胚层细胞中和叶子的表皮细胞中表达（WyattRE,化gaoRT,IfeyJL.Patternsof soybeanproline-richproteingeneexpression.ThePlantCellOnline. 1992， 4: 99-110. )。GmPRP化-1062是大豆（G炒偷戶瓜巧^的启动子，在大豆的毛状根和拟 南芥的根中优先表达（QienLJiangB,WuC,SunS,HouW,HanT?紐?戶瓜^promoter drivesroot-preferentialexpressionintransgenicArabidopsisandsoybeanhairy roots.BMCplantbiology. 2014,14: 245.)。
[0006] PRPs在抵抗真菌胁迫中有重要的作用。研究表明，沉积和交联在珍珠粟 (戶€打(歴知auc歴）植物细胞壁的PRPs对植物病原菌优7知(9677(9拘妍，細?7a有抵 抗和屏障作用Oe邵akS,沈ailasreeS,Sujeeth化Kini服，沈ettySH,MithSferA. Purificationandcharacterizationofproline/hydroxyproline-richglycoprotein frompearlmilletcoleoptilesinfectedwithdownymildewpathogenSclerospora 贫ra掛i打ic(97a.Phytochemistry. 2007，68: 298 - 305.)。拟南芥中编码曲戶化的劍化i7 基因具有抗真菌的功能。Nc^thern印迹杂交结果显示，灰霉病菌（化》化7(/6*cinarc苗接 种处理可臥诱导拟南芥劍化//基因的表达。采用台m蓝染色观察真菌侵染状况，发现灰 霉病菌对超表达劍化打的植株叶片的侵染程度比野生型植株的叶片要轻，而劍化//基因 突变体植株叶片被侵染的程度较为严重（徐丹.拟南芥劍化//基因在生物和非生物胁迫 中的抗性功能.西北大学硕±学位论文.2010.)。平板抑菌实验表明，重组EA化II蛋白 明显抑制了尖抱镶刀菌（化〇巧呵W/??)、灰葡萄抱（原cina/知）分生抱子的萌发 和菌丝生长（LiL,ZhangC,XuD,SchlappiM,XuZQ.Expressionofrecombinant EA民LIl,ahybridproline-richproteinofArabidopsis,inEscherichiacoliand itsinhibitioneffecttothegrowthoffungalpathogensandSaccharomyces cerevisiae.Gene. 2012，506: 50 - 61.)。
[0007] 本发明中富含脯氨酸蛋白/5?户化7来自濛潰大泡核桃（/媒si知77別aDode)。 濛潰大泡核桃是目前云南主要的核桃栽培品种，具有果大、壳薄、仁白、味香、出油率高、营 养丰富等优点，并且对病原真菌胶抱炭痘菌具有较强的抗性。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种从濛潰大泡核桃中克隆获得具有抗真菌活性的富含脯 氨酸蛋白的全长基因/5/WW，的核巧酸序列如SEQIDNO; 1所示，该基因全长为815 bp，包含一个408bp的开放阅读框、123bp的5'非翻译区（untranslatedregions，UTR) 及284bp的3'UTR，编码如SEQIDNO;2所示氨基酸序列的蛋白质。
[0009] 本发明所述富含脯氨酸蛋白基因户足^的编码区是序列表SEQIDNO;1中第 124-531位所示的核巧酸序列。
[0010] 本发明分离克隆濛潰大泡核桃的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，通过根 癌农杆菌（瓜TO知C妃riuffltoffle/aciens)介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通 过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物 抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将该个基因命名为/5/WW。
[0011] 植物PRPs特异定位于细胞壁，属于细胞壁结构蛋白，但与细胞膜也有相互作用。 PRPs在构建植物的细胞壁结构方面起作用，在生物和非生物胁迫下诱导表达，是植物防御 系统中重要的组成成分。PRPs的表达能提高植物组织的木质化水平，增强细胞壁的机械强 度，而细胞壁是病原体入侵植物的第一道物理屏障，PRPs在植物防卫反应中起到积极的作 用。另外，巧?基因的启动子片段中含有多个与脱水、病原物、高盐、低温等逆境相关的诱 导元件，超表达巧?/莖因能提高转基因植物的抗病性。
[0012] 本发明设及分离包含的DNA片段并鉴定其功能，具有该基因片段的植物在 一定程度上具有抵抗特定真菌入侵的表型。其中所述DNA片段如序列表所示，对该基因进 行分析，表明化料全长cDNA为815bp，包含一个408bp的开放阅读框、123bp的5'UTR 及284bp的3'UTR，其中0RF编码一个具有135个氨基酸的蛋白质。BLAST分析结果显 示濛潰大泡核桃巧PW编码的蛋白质与甜澄PRP(仿皆si/?e/7sis，XP_006477234. 1)的 氨基酸序列具有84%的相似性。JsPRPl含有N端信号肤、富含脯氨酸重复区域和C端8个 特定排列的半脱氨酸，具有典型的PRPs特征，该表明其属于濛潰大泡核桃中的富含脯氨酸 蛋白。超表达序列表SEQIDNO;1所示序列可W增强烟草对胶抱炭痘菌（仿WefWric扣/曲 gloeosporioides)、孩盛舊iScleroti打iascyei-ofioru曲）、葡萄座月空菌（公〇 沁沁a)W及串珠状赤霉菌（GiA如'eWa 的抗性。
[0013] 上述基因可W应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下： (1)采用扩增的特异引物，从接种胶抱炭痘菌后的濛潰大泡核桃叶中提取 总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechain reaction，RT-PCR)扩增出/s户足^的全长编码区，然后将其连接到pMD-lST载体上，经测序 获得具有目的基因的克隆。
[0014] 似用限制性内切酶伽册和仿oRI酶切pMD18-T-/s/WW载体和植物表达载体 PCAMBIA2300S，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段。再将所获得基因片段 与PCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体。之后将所构建的重组载体通过根癌 农杆菌介导转入烟草中表达。
[0015] (3)W重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCRW及RT-PCR检 测得到阳性转基因植株，分析转基因植株对于病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明 显增强的转基因植株。
[0016] 本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培 育抗病植物可W克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材 料。本发明中来自濛潰大泡核桃的基因能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基 因导入烟草中，可W产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植 物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可W为大规模生产作物、花弁 等提供方便，减少化学农药的使用，还可W为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发 明具有广阔的市场应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明中部分巧沪巧专基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，其中Marker; DL2000DMMarker(大连宝生物），由 2,000bp、l，000bp、750bp、500bp、250bpW及 100bp六条DNA片段组成；正对照：质粒PMD18-T-/S巧为模板的PCR反应；WT;非转基因 烟草（野生型）总dm为模板进行的PCR; 图2是本发明中部分阳性转基因烟草中转录水平的表达分析结果图， 其中Marker;DL2000DMMarker(大连宝生物）；WT;非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为 模板的PCR产物；正对照：质粒PMD18-T-/S巧为模板的PCR产物； 图3是本发明中转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图；其中a、b、C、d图 示中的真菌分别是核盘菌、胶抱炭痘菌、串珠状赤霉菌W及葡萄座腔菌；WT为野生型烟草 的总蛋白；CK为空白对照，即无蛋白对照（用于提取蛋白的缓冲液）。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内 容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常 规试剂或按常规方法配置的试剂。
[0019] 实施例1 全长cDNA克