隆W及序列分析 用胶抱炭痘菌接种濛潰大泡核桃，用接种后4h的叶提取总RNA，用液氮将处理过的濛 潰大泡核桃的叶研磨成粉末，然后转入离屯、管中，采用异硫氯酸脈法提取总RNA。采用逆转 录酶M-MLV(promega)W总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为；取5yg totalRNA，依次加入 50ngoligo(dT)，2uLdNTPMix(2. 5mleach),用DEPC水将反 应体积补齐至14. 5yL;混匀后，70°C加热变性5min后迅速在冰上冷却5min,然后依次 加入 4uL5XFirst-standbuffer、0. 5uLRNasin(200U)、1yLM-MLV(200U)，混匀 并简短离屯、，42°C温浴1.5h，取出后70°C加热10min,终止反应。cDNA第一链合成后置 于-20°C保存备用。
[0020] W合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因/如?/乂所用上下游引物序列分别为 5' -CAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG- 3'及y-ACCTTGCATCCATCGAAACAAT- 3'。采用Advantage? 2PCREnzyme(Clontech)扩增出目的基因。PCR反应条件；95°C1min;94°C30S，60°C30s，72°C45s，32 个循环；72°C5min。反应体系（20uL)为 1uLcDNA、2uL lOXAdvantage2PCRBuffer、1.8uLdNTPMix(lOmMeach)、0.2uL正向引物（10 jiM)、0. 2uL反向引物（10jiM)、0. 2uLAdvantage2PCRPolymeraseMix、14. 6uL PCR-Gradewater。PCR结束后，取8yL进行琼脂糖凝胶电泳，用W检测扩增产物的特异性 W及大小。
[0021] 所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒 为PMD18-Tvectorkit(大连宝生物），反应体系和操作过程为：取1.5uLPCR产物，依 次加入 1uLpMD18-Tvector(50ng/uL)和 2.5uL2XLigationsolutionI，混匀 后置于16°C过夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌D册a感受态中。用含 有氨节青霉素（ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个单菌落，摇 菌后用扩增的特异引物检测多克隆位点插入的克隆。将得到的阳性克隆 进行测序，最终获得的化W全长cDNA为815bp，通过NCBI0RFfinder〇ittp:/7w丽. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/go;rf.html)分析发现其包含一个408bp的开放读码框（见序列 表）。巧PW编码一个含135个氨基酸的蛋白质JsPRPl，其分子量约为14. 17KDa，等电点 为8. 91。借助生物信息学软件Signal? 4. 1分析巧PW编码的蛋白序列，检测其是否具有 N端信号肤。结果显示在JsPRPl的N端存在信号肤，因此推测该蛋白是分泌蛋白。
[0022] 实施例2 ;植物超表达载体构建 采用SanPrep柱式质粒DM小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入/s巧PW的大肠杆 菌质粒PMD18-T- /s/WWW及植物表达载体PCAMBIA2300S质粒，取1yL用于琼脂糖凝胶 电泳W检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶仿oRI(TaKaRa)和化細I (TaKaRa)分别对质粒PMD18-T-/S巧沪巧日PCAMBIA2300S进行双酶切（100yL体系），反 应体系和操作过程为；分别取20yLPMD18-T-/S巧沪巧日PCAMBIA2300S质粒、依次加入10 UL10XKbuffer、5uL仿〇《/、5uL公a紐1、60uLd地2〇,混匀后短时离屯、，置于37°C 过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用SanPrep柱式DM胶回收试剂 盒（上海生工）对化W片段和PCAMBIA2300S载体大片段分别进行胶回收，取1yL回 收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小W及浓度，置于-20°C保存备用。
[0023] 利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的巧沪iDNA片段和PCAMBIA2300S载体 片段连接起来，反应体系（20 y L)和操作过程为：取10 y L /S/WWDNA片段依次加入2 UL PCAMBIA2300S载体DNA、2 uL 10XT4 DNA Ligase Buffer、！uL T4 DNA Ligase、5 UL d地2〇,混匀后短时离屯、，然后16°C水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转 入大肠杆菌D册a中，用含有50 mg/L卡那霉素化anamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克 隆。挑选单菌落摇菌，W菌液为模板用扩增的特异引物进行PCR，挑选出与 PCAMBIA2300S成功连接的克隆，并向检测得到的阳性菌株中加入甘油并置于-80°C保存备 用。
[0024] 采用SanPr巧柱式质粒抽提试剂盒（上海生工）提取并纯化上述大肠杆菌 D册a中的PCAMBIA2300S-/S化料质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体 PCAMBIA2300S-/S/WW转入所制备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取 2ygPCAMBIA2300S-/S巧沪2质粒加入含有200uL感受态细胞的离屯、管中，轻轻混匀后 冰浴5min,随后转入液氮中冷冻1min,然后迅速置于37°C水浴5min,再冰浴2min,之 后加入500yLLB液体培养基于28°C振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/ LKm的LB固体培养基上，28°C倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增的特异性引物 进行PCR反应，检测PCAMBIA2300S-/S化料是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后 置于-80 °C保存备用。
[00巧]实施例3 ;农杆菌介导的植物遗传转化W及转基因植物筛选 本实验的转基因受体是烟草OVicWiana 知cufflL.)。将烟草种子用75%的酒精浸泡 30S，无菌水洗漆后用0. 1%的化Cl2浸泡8min,然后再用无菌水洗漆若干次，播种于1/2MS培养基上，28°C暗培养5-8山发芽后转至光照培养箱（25°C，16h/d光照），W后每月用 MS培养基继代一次。
[0026] 从-80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-/s/WW质粒的农杆菌LBA4404菌 种，取20uL接种于5血含有50mg/LKm和20mg/L利福平的LB液体培养基中，28°C培 养至培养基浑浊。吸取1mL浑浊的菌液至含有50mg/LKm的LB固体培养基上，28°C培养 48h。随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mg/L的己酷了香酬的 M化液体培养基中，28°C振荡培养5-8hW活化农杆菌。
[0027] 取烟草无菌烟草幼嫩叶片切成约1cm2的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌 的M化液体培养基中，25°C浸染15min。用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培 养基上，22°C无光条件下共培养2天。烟草转化的共培养基为MS+0.02mg/L6-BA+2. 1mg/ LNAA+30g/L庶糖+6g/L琼脂。
[0028] 将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基 因植株。烟草筛选培养基为MS+0. 5mg/L6-BA+0. 1mg/LNAA+30g/L庶糖+6g/L琼脂 +50mg/LKm+200mg/L头抱霉素（cefotaximesodiumsalt,Cef);筛选培养时将培养瓶 转移至光照培养箱培养（25°C，16h/d光照，8h/d黑暗）。待烟草长出芽后用含有50mg/ LKm和200mg/LCef的MS培养基继代培养。因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株 进行进一步筛选。将烟草再生苗移至含有50mg/LKm的MS培养基上使其生根，最后选用 生根较好的再生苗做进一步的检测。
[0029] 采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取1yL所得基因组DNA进 行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。W转基因植株的基因组DNA为模板用的 特异引物进行PCR反应。PCR结束后，取8UL产物用于琼脂糖凝胶电泳W检测阳性转基因 植株。部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，转基因烟草共筛选到32株阳 性转基因植株。
[0030] 实施例4 ;转基因烟草中的表达分析W及转基因植株抗真菌活性分析 分别取阳性转基因植株W及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDM第一链，并W此为模板用扩增户足^的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基 因植株中巧沪巧专录水平的表达量。总RNA提取W及RT-PCR的方法与实施例1中相同。 PCR结束之后，取8yL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到 20个转基因单株中在转录水平大量表达，该些单株的编号为1~20。
[0031] 将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基（200g/L马铃馨，15g/L琼脂， 20g/L葡萄糖）上，28°C暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植 株体外抗真菌活性。胶抱炭痘菌（C如9e(〇s/7ari(9it/es)、核盘菌（5： 葡萄 座腔菌（公.沁沁<3)、和串珠状赤霉菌（G 为了防止其它杂菌污染所提 取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作。首先取1g转基因烟草单株（编号分别 为3、4、6、10)及野生型叶片放入研鉢中，加入1血蛋白提取液（1M化C1，0. 1M己酸钢， 1〇/〇PVP，P册.0)，充分研磨。转入1.5血离屯、管中，混匀后4°C静置过夜。4°C离屯、30min (12,000g)，取上清于新的1.5血离屯、管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。 将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2yg/uL然后分别取20UL滴于各真 菌培养基的无菌滤纸上。在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同 时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（蛋白提取液）。28°C培养几天后观察各处理 真菌生长的情况，并据此来评价转基因烟草的体外抗真菌活性。结果如图3所示， 转基因烟草蛋白对胶抱炭痘菌、核盘菌、葡萄座腔菌W及串珠状赤霉菌的生长具有 明显的抑制作用。
【主权项】
1. 一种漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO:1 所示。
2. 权利要求1所述的漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因在提高烟草对胶孢炭 疽菌、核盘菌、葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌抗性中的应用。
3. 根据权利要求2所述的漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因/#^7的应用，其特征在 于提高烟草的真菌抗性的具体操作如下： (1) 将漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因与植物超表达载体PCAMBIA2300S连 接，构建植物超表达载体； (2) 将上述构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中； (3) 以重组载体T-DNA上具有的卡那霉素抗性基因来筛选转化子，并通过聚合酶链式 反应筛选获得阳性转基因植株，接种特定病原真菌，分析转基因烟草蛋白对真菌生长的抑 制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。
【专利摘要】本发明公开了漾濞大泡核桃富含脯氨酸蛋白基因JsPRP1及应用，JsPRP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码富含脯氨酸蛋白，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实JsPRP1基因具有提高植物抗真菌侵染的功能，将本发明抗真菌JsPRP1基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性；JsPRP1超表达的转基因烟草对胶孢炭疽菌、核盘菌、葡萄座腔菌以及串珠状赤霉菌的生长具有明显的抑制作用。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-84, C12N15-29
【公开号】CN104774847
【申请号】CN201510118386
【发明人】刘迪秋, 韩青, 陈朝银, 陈瑞, 葛锋
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月18日