果梅PmARF基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及果梅PmARF基因及其应用，具体涉及包括该基因 的重组载体和工程，以及在植物花器官形态培育和改良中的应用。
【背景技术】
[0002] 植物的花器官发育是植物发育过程中最引人注目的事件，花芽的形成意味生殖生 长的开始。而花器官发育不良也严重影响植物的产量，因此对植物花发育进行研宄对生 产具有重要而深远的意义。生长素响应因子（Auxin response factor，ARF)是Ulmasov 等（Ulmasov et al.1999)发现的能与生长素早期反应基因启动子中的生长素应答元件 (AuxRE) TGTCTC序列特异性结合，调节生长素反应基因表达的转录激活或抑制的一类新的 转录因子。有关ARF生物学功能的主要资料最早来自拟南芥ARF基因功能缺失突变体表型 的研宄：缺失ARF5使得叶维管大大减少，并影响了胚轴的形成，暗示该基因在维管组织的 形成和发育中起作用（Hardtke et al 1998);缺失ARF3会导致蕊基部及顶端发育不良，其 最明显的表型为雌蕊的背腹结构混乱，说明ARF3可能与调节花器官的发育有关（Session RA. 1997);拟南芥共生同源生长素反应因子arf6和arf8单个突变体都表现出花成熟期推 迟和生育率降低的现象，但arf6arf8双突变会导致植株在幼苗发育之前就阻止花的发育 并且种子完全不育（Nagpal et al. 2005)，arf6和arf8双突变体还能造成花芽败育、花瓣 短、雄蕊细丝短、花药不张裂，导致不释放花粉和雌蕊不成熟。这些研宄都表明ARF对植物 的花器官，尤其是雌蕊发育起着至关重要的作用。但这些研宄主要在模式植物开展，而木本 植物雌蕊形成与发育的分子基础研宄报道较少，更没有系统地研宄这些基因在木本植物雌 蕊形成和发育中的分子机理。
[0003] 梅（Prunus mume Sieb. et Zucc.)属蔷薇科（Rosaceae)李属 Prunus L.)，原产 我国，栽培历史悠久。在广东和云南等地民间都有用梅做菜的传统。在日本是作为佐餐的 必需品，梅酒和饮料也很畅销，因此每年梅果实的需求量很大，需要从我国大陆和台湾地区 等地进口，梅果实也是我国梅产区重要的出口创汇果品之一。但果梅产量偏低，严重制约 了果梅进一步发展。造成产量低的重要原因之一是花器官发育不良。主要表现为花器中缺 少雌蕊形成空心花或子房枯萎、花柱短缩或弯曲、子房瘦小，这样的畸形花统称为不完全花 (也称为雌蕊败育花）。梅雌蕊原基分化期的雌蕊畸形率大大低于花期雌蕊畸形率，说明梅 的不完全花可能主要是在雌蕊结构分化期由于雌蕊发育异常而形成。果梅雌蕊败育的现象 并不是整株花器官变异，而是同一植株上同时存在雌蕊发育正常和雌蕊没有或发育不完全 的败育花，因此DNA遗传背景相同，但表型不同，可能的调控机理和相关的基因和拟南芥等 模式植物也不尽相同。但上述研宄为分离和鉴定果梅雌蕊败育的相关基因提供参考依据。
[0004] 总体来看，中国果树转基因研宄已经进入国际先进行列，在抗病、抗虫、抗逆性等 转基因研宄领域已经取得了重要进展，为提高果树育种效率，缩短果树育种周期，加快果树 产业的技术进步和结构调整提供了新的途径。但是对于中国未来转基因果树研宄影响最大 的是中国克隆的具有自主知识产权的功能基因较少，往往是一个基因在十几个物种中开展 遗传转化；此外遗传转化效率较低，也在一定程度上制约了中国转基因果树研宄取得更大 进展。因此，当前的研宄重点应放在利用中国丰富的果树种质资源克隆果树自身重要功能 基因，提高基因转化效率以及开发转基因新技术上。'大嵌蒂'是中国果梅特有的种质资源， 由于其不完全花比例高达76%，严重影响果梅的产量，从而为我们研宄花器官发育尤其是 雌蕊发育提供了良好的种质资源。从'大嵌蒂'上克隆相关基因导入烟草中，进而特异性研 宄其对花芽发育过程，乃至花器官形态建成的影响因素，尤其是为研宄雌蕊发育提供良好 契机。更为开发具有中国自主知识产权的果树抗逆性基因鉴定坚实了的基础。。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一个果梅基因 PmARF及其应用。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现
[0007] 1.本发明提供一种果梅PmARF基因，该基因序列如SEQ ID NO. 1，该基因不仅参与 花器官的形态建成，还参与调控植物、植物叶片的衰老速度，是一个多效型转录因子。
[0008] 2.本发明还提供一种包括上述1提供的果梅PmARF基因的表达载体。
[0009] 3.上述2所述表达载体，其原始载体为PBI-121载体，在xbal和SmaI酶切位点引 入果梅PmARF基因的cDNA。
[0010] 4.本发明还提供一种含有上述2或3提供的表达载体的工程菌。
[0011] 5.上述4提供的工程菌，该工程菌为农杆菌。
[0012] 6.本发明还提供上述1提供的基因或者上述2提供的表达载体在花器官形态培育 中的应用。
[0013] 7.上述1提供的基因或者上述2提供的表达载体在植物改良中的应用，其中，改良 方向包括延长植物存活期，提高植物产量。
[0014] 8.上述7提供的应用，其中，所述植物为果梅或者烟草。
[0015] 9.本发明提供上述1提供的基因在烟草品种改良方法的应用，该应用包括如下步 骤：
[0016] 1)基因开放阅读框的克隆：根据梅基因组序列Pm019941最大开放阅读框两端设 计引物，上游引物PmARFl 1-F，序列如SEQ ID NO. 2所示，下游引物PmARFl 1-R，序列如SEQ ID NO. 3所示；CTAB法提取果梅品种'大嵌蒂'的总RNA，根据TaKaRa公司反转录试剂盒，合 成cDNA第一链；以cDNA第一链为模板，PmARFl 1-F、PmARFlI-R为引物，PCR扩增，获得长度 为2136bp的cDNA序列，命名为PmARFll ;
[0017] 2)植物表达载体的构建：设计含有xbal和SmaI酶切位点的特异引物，上游引物 PmARFll-MF :序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物PmARFll-MR :序列如SEQ ID NO. 5所示， 其中，PmARFlI-MF含有xbal酶切位点TCTAGA，PmARFlI-MR含有SmaI酶切位点CCCGGG ;以 PmARFll为模板，PmARFll-MF、PmARFll-MR为引物，PCR扩增，将酶切位点引入PmARFll的基 因序列中；PBI-121载体进行xbal和SmaI双酶切，获得酶切大片段；T4连接酶连接引入酶 切位点的PmARF 11和PB I -121载体大片段，获得重组植物表达载体PB I -121，PCR酶切鉴定；
[0018] 3)遗传转化：冻融法将重组植物表达载体PBI-121转化农杆菌EHA105,挑取单菌 落于50ml含Km 50mg/L+Rif 50mg/L的YEB液体培养基中28°C，200r/min振荡过夜培养， 菌液PCR鉴定阳性克隆；待阳性克隆的菌体0D600值达到0. 5,5000rpm离心10min，弃上清， 沉淀用50ml的无菌MS液体培养基重新悬浮培养；利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得 转基因烟草株系。
[0019] 10.上述9所述应用，其中，步骤⑴中PCR扩增条件为，反应体系，PCR缓冲液， 2.5 41^(1阶13,2 41^;]\%(：12，1.5 41^;稀释10倍的。0嫩，141^上游引物？11^1^11-卩，0.5 41^; 下游引物 PmARFll-R，0. 5yL ;rTaq 酶，0· 2yL ;ddH20，16.8yL ;其余用水补齐至 25yL ; 反应流程，94°0,3〇8,72°0,21^11，5个循环；94°0,3〇8,62°0,4〇8,72°0,21^11，共5个循环 ； 94°C，30s，6(TC，40s，72°C，135s 共 32 个循环；72°C，IOmin ;
[0020] 步骤（2)PCR扩增条件为，反应体系，稀释10倍的cDNA，I. 0 μ I ;5XPrimeSTAR GXL 缓冲液，5.0以1;(1阶13,2 4 1^上游引物？11^1^11-]\^，0.3 4 1;下游引物？11^1^11-]\?，0.3 4 1; PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶，0. 5 μ I ;ddH20 补齐体系至 25 μ 1。
[0021] 有益效果：
[0022] 1.本发明首次从果梅品种'大嵌蒂'克隆得到了一个新的PmARF基因，通过NCBI 在线BLAST软件将'大嵌蒂' PmARFll基因氨基酸序列与NCBI上登录的其它物种进行序列 比对，PmARFll与桃、苹果、草莓、毛果杨和拟南芥、同源性分别为91%、71%、67%、60%和 58%〇
[0023] 2.将本发明基因 PmARF转入烟草中获得转基因烟草，与野生型烟草相比，转基因 植株烟草花与野生型相比其花器官具有一定差异，具体表现为，转基因植株花瓣深裂，颜色 较深，开花期明显延长，转基因雌蕊较野生型雌蕊稍长，叶片衰老加速和植株的生长周期延 长，表明转PmARFll基因不仅参与花器官的形态建成，还参与调控植物叶片的衰老速度，故 得出结论PmARFll在植物体中是一个多效型转录因子。这为将该基因应用于花器官形态培 育提供可能。同时，由于获得PmARFll基因的烟草，其生长周期增长，衰老速度明显减慢，因 此，可以预测，如果将PmARFll基因转入植株中，可以延长植物存活期，提高植物的产量。
【附图说明】
[0024] 图I :A :PBI121载体的酶切产物
[0025] M !Marker，P1-P2 :PBI121载体酶切后的大片段产物
[0026] B :PBI121-PmARFll 酶切鉴定
[0027] M :marker，1-4 :PBI121-PmARFll 质粒
[0028] 图2 :转PmARFll基因烟草的获得
[0029] A :转基因烟草的愈伤组织，B :筛选的的阳性植株，C :生根培养的转基因植株。
[0030]