图3 :转基因烟草⑶S检测，其中，CK为阴性对照，1-10为转基因烟草株系
[0031] 图4 :转PmARFll基因烟草PCR检测
[0032] P :阳性对照（质粒），CK :阴性对照，1-10 :转基因烟草株系
[0033] 图5 :转PmARFll基因烟草RT-PCR检测
[0034] P :阳性对照（质粒），CK :阴性对照，1-10 :转基因烟草株系
[0035] 图6 :野生型烟草和转基因烟草叶片中激素含量
[0036] 图7 :野生型烟草和转基因烟草不同时期花芽中叶片中激素含量比值
[0037] 图8 :野生型与转PmARFll基因烟草花期表型观察
[0038] 图9 :转基因烟草早期花芽中PmARFll基因的表达水平
[0039] 1、2、3、4代表不同时期的转基因烟草早期花芽；I :0. 5cm的花芽；2 :1cm的花芽； 3 :1. 5cm的花芽；4 :2. Ocm的花芽
[0040] 图10 :转基因烟草不同花器官中PmARFll基因的表达水平
[0041] 图11 :转PmARFll基因烟草雌蕊和雄蕊的⑶S染色对比图片
[0042] 图12 :野生型（A)与转PmARFll基因烟草⑶表型比较
[0043] 图13 :野生型与转PmARFll基因烟草的生长周期观察
【具体实施方式】
[0044] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0045] 实施例1
[0046] 基因开放阅读框的克隆
[0047] 采取果梅品种'大嵌蒂'（其他同行出于研宄的目的，本申请人愿意提供该品 种）11月中旬的花芽，总RNA的提取参考蔡斌华等改进的CTAB法（蔡斌华，张计育，高志 红，渠慎春，佟兆国，靡林，乔玉山，章镇.一种改良的提取草莓属叶片总RNA的方法[J].江 苏农业学报，2008, 24 (6) :875-877)，cDNA 第一链的合成参照 PrimeScript II IstStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)操作说明书。因为果梅与桃具有很高的相似性，所以根据 已报到的桃基因组序列，通过本地BLAST软件分析，检索梅基因组，然后根据梅基因组序列 Pm019941最大开放阅读框两端分别设计引物！PmARFll-F :5' -ATGGCACCGAGGACGACT-3' ； PmARFll-R:5'-TTAGAGGGATGTTGCATTTGG-3'。以第一链 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 的 反应体系为 25 μ L，反应程序：94°C，30s，72°C，2min，5 个循环；94°C，30s，62°C，40s，72°C， 2min，共 5 个循环；94°C，30s，60°C，40s，72°C，135s，共 32 个循环；72°C，lOmin，4°C保存；并 将扩增得到的片段回收、转化和测序。经过PCR扩增和产物测序后得到一条长度为2136bp 的 cDNA 序列，通过生物信息学软件 Bioxm2. 6 和 ExPASy 中 ProtParam (http ://web. expasy. org/protparam/)在线工具进行分析所知，该基因为编码712个氨基酸残基的蛋白，命名该 基因为PmARFl 1，序列如SEQ ID NO. 1所示。PmARFll编码蛋白PmARFll含有3个蛋白结构 域，从氨基端至羧基端依次为：B3、Auxin-resp、AUX-IAA。其中B3-DNA能够特异的结合在早 期生长素响应基因的AuxRE(auxin_responsive cis-acting elements)元件，从而促进或 抑制生长素早期响应基因（Aux/IAA，GH3,and SAUR)的表达，进而促使植物感知生长素的信 号传递，影响植物的侧根生长，茎的顶端优势，花器官及胚胎发育等。通过NCBI在线BLAST 软件将'大嵌蒂' PmARFll氨基酸序列与NCBI上登录的其它物种进行序列比对，PmARFll与 桃、苹果、草莓、毛果杨和拟南芥、同源性分别为91%、71%、67%、60%和58%。
[0048] 实施例2
[0049] 植物表达载体的构建
[0050] 根据载体和PmARFll基因的酶切位点，设计含有xbal和SmaI基因特异引物，上游 引物 PmARFll-MF :5' -GCTCTAGAATGGCACCGAGGACGACTG-3'，下划线部分为 xbal 酶切位点； 下游引物 PmARFll-MR :5' -CCCCCGGGTTAGAGGGATGTTGCATTTG-3'，下划线部分为 SmaI 酶切位 点。以基因 PmARFll的全长cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：
[0051]
【主权项】
1. 一种果梅PmARF基因，其特征在于：该基因序列如SEQ ID NO. 1，该基因不仅参与花 器官的形态建成，还参与调控植物、植物叶片的衰老速度，是一个多效型转录因子。
2. 包括权利要求1所述的果梅PmARF基因的表达载体。
3. 权利要求2所述表达载体，其特征在于：所述表达载体原始载体为PBI-121载体，在 xbal和SmaI酶切位点引入果梅PmARF基因的cDNA。
4. 含有权利要求2或3所述表达载体的工程菌。
5. 权利要求4所述工程菌，其特征在于：所述工程菌为农杆菌。
6. 权利要求1所述基因或者权利要求2所述表达载体或者4所述工程菌在花器官形态 培育中的应用。
7. 权利要求1所述基因或者权利要求2所述表达载体或者4所述工程菌在植物改良中 的应用，其中，改良方向包括延长植物存活期，提高植物产量。
8. 权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物为果梅或者烟草。
9. 上述1所述基因在烟草品种改良方法的应用，其特征在于：该应用包括如下步骤： 1) 基因开放阅读框的克隆：根据梅基因组序列Pm019941最大开放阅读框两端设计引 物，上游引物PmARFl 1-F，序列如SEQ ID NO. 2所示，下游引物PmARFl 1-R，序列如SEQ ID NO. 3所示；CTAB法提取果梅品种'大嵌蒂'的总RNA，根据TaKaRa公司反转录试剂盒，合成 cDNA第一链；以cDNA第一链为模板，PmARFl 1-F、PmARFll-R为引物，PCR扩增，获得长度为 2136bp 的 cDNA 序列，命名为 PmARFll ; 2) 植物表达载体的构建：设计含有xbal和SmaI酶切位点的特异引物，上游引物 PmARFll-MF :序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物PmARFll-MR :序列如SEQ ID NO. 5所示， 其中，PmARFll-MF含有xbal酶切位点TCTAGA，PmARFll-MR含有SmaI酶切位点CCCGGG ;以 PmARFll为模板，PmARFll-MF、PmARFll-MR为引物，PCR扩增，将酶切位点引入PmARFll的基 因序列中；PBI-121载体进行xbal和SmaI双酶切，获得酶切大片段；T4连接酶连接引入酶 切位点的PmARF 11和PB I -121载体大片段，获得重组植物表达载体PB I -121，PCR酶切鉴定； 3) 遗传转化：冻融法将重组植物表达载体PBI-121转化农杆菌EHA105,挑取单菌落于 50ml含Km 50mg/L+Rif 50mg/L的YEB液体培养基中28°C，200r/min振荡过夜培养，菌液 PCR鉴定阳性克隆；待阳性克隆的菌体0D600值达到0. 5,5000rpm离心10min，弃上清，沉淀 用50ml的无菌MS液体培养基重新悬浮培养；利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得转基 因烟草株系。
10. 权利要求8所述应用，其特征在于：步骤（1)中PCR扩增条件为，反应体系，PCR缓 冲液，2. 5 y L ;dNTP，2 y L;MgC12,1. 5 y L ;稀释 10 倍的 cDNA，I y L ;上游引物 PmARFll-F， 0? 5 y L ;下游引物 PmARFl 1-R，0? 5 y L ;rTaq 酶，0? 2 y L ;ddH20,16. 8 y L ;其余用水补齐至 25 1^;反应流程，94°〇，3〇8,72°〇，2111111，5个循环；94°〇，3〇8,62°〇，4〇8,72°〇，2111111，共5个 循环；94°C，30s，60°C，40s，72°C，135s 共 32 个循环；72°C，IOmin ; 步骤（2) PCR扩增条件为，反应体系，稀释10倍的cDNA，I. 0 y I ;5 X PrimeSTAR GXL缓 冲液，5. 0 y I ;dNTP，2 y L ;上游引物 PmARFll-MF，0? 3 y 1 ;下游引物 PmARFll-MR，0? 3 y 1 ; PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶，0. 5 y I ;ddH20 补齐体系至 25 y 1。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，提供一种果梅PmARF基因及其应用，具体涉及包括该基因的重组载体和工程，以及在植物花器官形态培育和改良中的应用。该基因序列如SEQ ID NO.1，该基因不仅参与花器官的形态建成，还参与调控植物、植物叶片的衰老速度，是一个多效型转录因子，与桃、苹果、草莓、毛果杨和拟南芥、同源性分别为91％、71％、67％、60％和58％。将本发明基因PmARF转入烟草中获得转基因烟草，与野生型烟草相比，转PmARF11基因不仅参与花器官的形态有差异，植物及叶片的衰老速度减缓，可以预测，如果将PmARF11基因转入植株中，可以延长植物存活期，提高植物的产量。
【IPC分类】C12N1-21, C12N15-84, A01H5-00, C12N15-29
【公开号】CN104805094
【申请号】CN201510219345
【发明人】高志红, 宋娟, 倪照君, 侍婷
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月30日