高分辨率解链的改进校准的制作方法
【专利说明】高分辨率解链的改进校准
[0001] 发明背景
[0002] 本发明涉及用于在高分辨率解链PCR实验中进行温度校准的方法或试剂盒。本 说明书进一步涉及用于最优校准的方法，其允许靶物和校准物的相同或相似解链温度的读 出。本说明书进一步涉及用于实施所述方法的仪器和执行所述方法的计算机程序。
[0003] 高分辨率解链（highresolutionmelting,HRM)是一种在PCR扩增后检测靶序列 中未知核酸变异的方法。与传统方法例如变性梯度凝胶电泳（DGGE)相比，HRM提供用于突 变扫描的几个优势。这些优势包括较低的试剂和样品消耗，较少的优化步骤以及在单次实 时定量PCR中可执行的封闭测试形式。
[0004] 在能够非共价结合双链核酸的特殊荧光DNA结合染料（例如LightCycler? 480Resolight染料，RocheAppliedScience，目录号 04909640001)的存在下，对长达约 250个碱基对的靶序列PCR扩增后，加入生成的扩增子的HRM步骤。因为所述荧光非共价 双链DNA结合染料不抑制PCR，所以其可以以饱和浓度加到扩增反应中。在HRM步骤中，所 述荧光非共价双链DNA结合染料被释放，且可以检测到野生型、纯合子和杂合子突变体之 间关于扩增子解链图谱的差异（ReedGH,KentJO,WittwerCT(2007),Pharmacogenomics 8 (6) : 597-608;WittwerCT(2009)，Hum.Mutat. 30 (6) : 857-859;Wittwer等，美国专利号 7, 582, 429)。
[0005] 根据点突变的类型，观察到的解链温度差异可能非常小。单核苷酸多态性（SNPs) 通常导致解链温度在约I. 〇°C(对于1类SNPs(C/T和G/A碱基改变）和2类SNP(C/A和G/T碱基改变））、约0? 5°C(对于3类SNPs(C/G碱基改变））和约0? 2°C(对于4类SNPs(A/ T碱基改变）为约0.2°C)之间的变化。与野生型相比，杂合子突变通常表现出不同的荧光 解链图谱（解链曲线形状），而纯合子突变通常导致与野生型非常相似的解链图谱，且仅能 通过较小的温度变化区分。
[0006] 关于HRM的现有技术展现出如本文下面所述的几个缺点。为了检测解链温度中的 小差异，要求测量系统极高的温度精度。实时PCR仪器通常设计为基于模块的系统，其使用 Peltier元件进行精确温度控制。然而，所述温度控制受制于物理限制，其由例如温度传感 器的校准、Peltier元件的控制以及微孔板个体和加热模块底座的几何契合所导致。这些 限制通常导致在加热模块中最热和最冷位置之间观察到的0. 5-1. (TC的温度范围。因此，反 应体积中的温度控制不允许在纯合突变体与其野生型相比具有非常相似的特征性解链图 谱（profile)的HRM实验中区分较小的温度变化。
[0007] 为了修正在基于模块的热循环仪的所有位置处不均匀的温度分布，目前建立了两 种不同的方法：
[0008] 在于特定的仪器上实施HRM实验之前，使用特殊的校准板来执行分开的温度校准 运行。将所有位置的所述模块特异性温度数据保存于所述仪器的软件中，并随后用于HRM 实验来修正所有位置的温度差异。这种方法建立用于例如AppliedBiosystems7500和 7900HT实时PCR系统（例如MeltDoctor?HRMCalibrationPlate，目录号PN4425618)和 BioradCFX实时PCR系统（例如MeltCalibrationKit，目录号 184-5020)。
[0009] 所述校准方法的缺点在于，当实施分开的温度校准运行时，温度不均一的实验特 异性原因无法被修正。这些包括微孔板个体在加热模块底座中的不同契合，以及从底座到 板和反应体积的温度传递中相关的差异。此外，例如由不同的离子强度（由纯化方法或样 品材料导致的）导致的不同反应条件影响观察到的解链温度。另外，Peltier模块的热老 化不能通过此方法补偿。
[0010] 1)在HRM试验中，内部的温度校准物被加到每一个反应中。所述温度校准物由未 标记的双链寡核苷酸组成，其采用低于或高于所述靶序列的预期解链温度的解链温度，并 使用在反应中存在的荧光非共价双链DNA结合染料来检测。基于测量到的孔与孔之间校 准物的温度差异，修正检测到的目标温度。这一方法建立用于例如IdahoTechnology的 LightScarmer⑧仪器（HighSensitivityMasterMix，目录号HRLS-ASY-0008)。
[0011] 温度校准物方法的缺点：对未标记的内部温度校准物的检测基于用于靶突变检测 的相同荧光非共价双链DNA结合染料的释放。因此所述目标解链温度必须与校准物解链不 重叠。这将扩增子的大小限制到约40-120个碱基对的范围。此外，根据靶物的G/C含量， 所述扩增子长度必须优化到适合于允许的解链温度范围。另外，所述扩增子解链的荧光亮 度必须不能胜过并因此遮盖内部校准物信号。荧光亮度强烈依赖于产生的PCR产物的量。 因此，在执行HRM实验之前，对于每一个靶物，开始核酸材料的量和引物的浓度必须优化。
[0012] 本说明书的目的是提供用于HRM的方法，其不显示上述缺点。 发明概要
[0013] 本说明书的第一个方面涉及用于PCR实验中温度校准的方法，其中所述方法包括 以下步骤a)在多孔板的每个孔中提供用于扩增样品中的特定靶核酸的反应混合物，其包 含荧光非共价双链DNA结合染料，b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价 结合所述双链寡核苷酸的第一条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二 条链，c)在每一个孔中扩增所述特定靶核酸，d)在每个孔中解链所述特定靶核酸从而导致 自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少，以及解链所述双链寡核苷酸从而 导致自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少，其通 过供体生色团和接受体生色团的空间分离进行，e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结 合染料的放射发射的减少，在每个孔中监控所述扩增的特定靶核酸的解链温度值，并分开 地通过检测自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减 少，在每个孔中监控所述双链寡核苷酸的解链温度，f)基于所述双链寡核苷酸解链温度值 的孔与孔差异，对于每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度值。
[0014] 本说明书的第二个方面涉及用于实施在上述PCR实验中的温度校准的试剂盒，其 中所述试剂盒包含a)用于在样品中扩增特定靶核酸序列所有的必要试剂，b)荧光非共价 双链DNA结合染料，c)双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一 条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链。
[0015] 本说明书的第三个方面涉及用于实施在上述PCR实验中的温度校准的反应混合 物，其中所述反应混合物包含a)靶核酸序列，b)用于扩增特定靶核酸序列的所有的必要试 剂，c)荧光非共价双链DNA结合染料，以及d)双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所 述双链寡核苷酸的第一条链，接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链。
[0016] 本说明书的第四个方面涉及用于在上述PCR实验中实行温度校准的仪器。
[0017] 本说明书的第五个方面涉及用于执行在上述PCR实验中温度校准的方法的计算 机程序。
【附图说明】
[0018] 图1 :本图显示了实施例1中32种野生型、32种杂合突变体和32种纯合突变体 在不使用校准物时的标准化解链曲线。所述实验在带有热学未校准的PCR模块的仪器上进 行。
[0019] 图2 :本图显示了实施例1中32种野生型、32种杂合突变体和32种纯合突变体在 使用校准物时的标准化解链曲线。所述实验在带有热学未校准的PCR模块的仪器上进行。
[0020] 图3 :本图显示了实施例1中，六个基因型变体在不使用校准物时的标准化解链曲 线。所述实验在带有热学预校准的PCR模块的仪器上进行。
[0021] 图4:本图显示了实施例1中，六个基因型变体在使用校准物时的标准化解链曲 线。所述实验在带有热学预校准的PCR模块的仪器上进行。
[0022] 发明详述
[0023] 下述定义用来说明和限定本文所用各种术语的含义和范围。
[0024] 术语"一个"、"一种"和"所述"除非上下文另有清晰说明，一般包括复数形式。
[0025]术语"扩增子"一般指代选择的扩增产物，其通过一组特定的正向和反向引物扩 增，例如那些通过本领域中已知扩增技术生产的。
[0026] 术语"扩增"一般指代从靶核酸产生复数核酸分子，其中引