物杂交到所述靶核酸分 子上的特定位点来提供用于聚合酶延伸的起始位点。扩增可以通过任何本领域众所周知的 方法实现，其诸如但不限于：标准PCR、长PCR、热启动PCR、qPCR、RT-PCR和恒温扩增。
[0027] 术语"校准物"或"温度校准物"用于本文指代携带FRET对的双链寡核苷酸，在所 述双链寡核苷酸解链时，可以检测到FRET对的一个配对物的发射波长。所述校准物用于高 分辨率解链实验从而确定在多孔板的孔中的温度差异，其由例如携带所述多孔板的加热模 块不规则或多孔板个体和加热模块底座的几何契合所导致。所述温度差异基于发射放射的 变化，通过精确测量校准物的解链温度确定。所述变化是强度变化（减少或增加）。
[0028] 术语"互补"一般指代两个核苷酸的碱基之间在合适的温度和离子缓冲条件下形 成有利的热力学稳定性和特异性配对的能力。这种配对依赖于每个核苷酸的氢键特性。最 基本的例子是胸腺嘧啶/腺嘌呤和胞嘧啶/鸟嘌呤碱基之间的氢键对。在本说明书中，用 于扩增靶核酸的引物可以是在其整个长度与靶核酸分子完全互补，或"半互补"，其中所述 引物包含另外的，最少或不能杂交到所述靶核酸的非互补序列。
[0029] 术语"染料"用于概括所有种类的光吸收分子，因此包含荧光染料、非荧光染料和 淬灭剂分子。淬灭剂分子能够淬灭荧光染料的荧光，因为其能够被荧光激发，并例如通过热 分发能量。非荧光染料是与传统的荧光染料相反，基本没有荧光发射的染料。
[0030] 术语"荧光非共价双链DNA结合染料"指代一种生色团，其能够结合双链DNA，并实 现qPCR实验中DNA形成和解链分析中解离的测量。所述荧光非共价双链DNA结合染料当 结合双链DNA时，以某一波长光的形式发射放射。如果所述双链DNA的两条互补链解离，例 如在解链实验中，则放射的发射减少。
[0031] 术语"FRET"或"荧光共振能量转移"或"福斯特（Foerster)共振能量转移"可 以交换使用，指代在至少两个生色团（一个供体生色团和一个接受体生色团）之间的能 量转移。当所述供体被合适波长的光放射激发时，供体生色团通常将能量转移到所述受 体。所述受体通常以不同波长的光放射的形式再发射转移的能量。当所述受体是"暗"淬 灭剂时，其以不同于光的形式散去转移的能量，例如以热的形式。通常使用的"暗"淬灭剂 包括BlackHoleQuenchers?(BHQ),(BiosearchTechnologies,Inc. ,Novato,Cal. ),Iowa Black?(IntegratedDNATech. ,Inc. ,Coralvilie,Iowa)，以及BlackBerry?Quencher 650 (BBQ-650)(Berry&Assoc. ,Dexter,Mich.) 〇
[0032] 术语"杂交"一般指代不同核酸分子之间与其核苷酸序列一致的碱基配对。术语 "杂交"和"退火"可以交换使用。
[0033] 术语"多孔板"用于本文如本领域的技术专家所知的，指代用于平行分析一个或多 个样品的物理、化学或生物学特性的板。多孔板包含96、384、1536或3467个分开的孔。该 术语也包括其它类型的反应设备例如8-孔条。
[0034] 在本发明背景中的术语"突变体"表示多核苷酸，其相对于对应的、天然存在的或 未修饰的核酸，包含一个或多个碱基替代。
[0035] 术语"核酸"或"多核苷酸"可以交换使用，指代可以对应于核糖核酸（RNA)或脱氧 核糖核酸（DNA)多聚物，或其类似物的多聚物。这包括核苷酸的多聚物例如RNA和DNA，以 及其合成形式，修饰（例如化学或生物化学修饰）形式，以及混合多聚物（例如包含RNA和 DNA亚基两者）。示例性修饰包括甲基化，使用类似物替代一个或多个天然存在的核苷酸， 核苷酸间修饰例如不带电连接（例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等），侧 基部分（例如多肽），嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等），螯合剂，烷化剂，以及修饰的连接 (例如alpha异头核酸等）。也包括模拟多核苷酸通过氢键和其它化学相互作用结合特定 序列的能力的合成分子。典型的，所述核苷酸单体通过磷酸二酯键相连，虽然合成形式的核 酸可以包含其它连接（例如肽核酸描述于Nielsen等，（Science254:1497-1500,1991))。 核酸可以是或可以包括例如染色体或染色体片段、载体（例如表达载体）、表达盒、裸DNA或 RNA多聚物、聚合酶链式反应（PCR)的产物、寡核苷酸、探针、和引物。核酸可以是，例如单链 的，双链的，或三链的，并不受限于任何具体长度。除非另有说明，除了任何明确指明的序列 外，具体的核酸序列包含或编码互补序列。
[0036] 术语"寡核苷酸"指代包括至少两个核酸单体单元（例如核苷酸）的核酸。寡核苷 酸典型的包括从约6到约175个核酸单体单元，更典型的从约8到约100个核酸单体单元， 还更典型的从约10到约50个氨基酸单体单元（例如约15个、约20个、约25个、约30个、 约35个或更多的核酸单体单元）。寡核苷酸的准确长度将依赖于多个因素，包括所述寡核 苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸任选的通过任何合适的方法制备，包括但不限于从存在 的或天然的序列中分离，DNA复制或扩增，逆转录，适当序列的克隆和限制性消化，或直接化 学合成，其通过例如Narang等的磷酸三醋方法（Meth.Enzymol. 68:90-99, 1979) ;Brown等 的磷酸二醋方法（Meth.Enzymol. 68:109-151，1979) ;Beaucage等的二乙基亚氨基磷酸醋 (diethylphosphoramidite)方法（TetrahedronLett. 22:1859-1862, 1981)；Matteucci 等的三酯方法（J.Am.Chem.Soc. 103:3185-3191，1981);自动化合成方法；或美国专利号 4, 458, 066的固相支持方法，或本领域技术人员已知的其它方法。
[0037] 术语"引物"一般指代寡核苷酸，其能够退火，或杂交到核酸序列，并在充分的条件 下（缓冲液、dNTPs、聚合酶、单价和双价盐、温度等）允许引物互补的核酸的延伸。
[0038] 术语"qPCR"一般指代被称为实时定量聚合酶链式反应、定量聚合酶链式反应或动 态聚合酶链式反应的PCR技术。这种技术使用PCR同时扩增和量化靶核酸，其中所述量化 是凭借嵌入的荧光染料或含有仅在杂交到靶核酸后可检测到的荧光报告分子的序列特异 性探针。
[0039] 术语"反应混合物"用于本文如本领域的技术专家所知，指代包含多种用于扩增 一个或多个靶核酸的试剂的水性溶液，包括酶、水性缓冲液、盐、引物、靶核酸以及核苷三磷 酸。所述反应混合物可以是完全的或不完全的扩增反应混合物。
[0040] 本文描述了用于PCR实验中温度校准的方法，其克服了已知温度校准方法的限 制。在使用根据本说明书的方法的HRM实验中，使用双链寡核苷酸作为温度校准物，将其加 到多孔板中的每一个反应中。所述双链寡核苷酸（本文也指代为"温度校准物"或"校准 物"）带有FRET对，在所述双链寡核苷酸解链时，可以检测到FRET对的一个配对物的发射 波长。基于所述双链寡核苷酸解链温度值的孔与孔之间的差异，将检测到的所述双链寡核 苷酸的解链温度值接下来用于修正多孔板每个孔的扩增的特定靶核酸的解链温度值。
[0041] 本说明书涉及用于PCR反应中温度校准的方法，其中所述方法包括步骤a)在多孔 板每个孔中提供用于扩增样品中的特定靶核酸的反应混合物，其包含荧光非共价双链DNA 结合染料；b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸 的第一条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链，c)在每个孔中扩 增所述特定靶核酸，d)在每个孔中解链所述扩增的特定靶核酸从而导致来自所述荧光非共 价双链DNA结合染料的放射发射减少，以及解链所述双链寡核苷酸从而导致自所述供体生 色团的放射发射增加或自所述接受体生色团的放射发射减少，其通过空间分离供体生色团 和接受体生色团进行，e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减 少，在每个孔中监控所述扩增的特定靶核酸的解链温度值，并通过检测自所述供体生色团 的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少，在每个孔中分别监控所述双 链寡核苷酸的解链温度值，f)基于所述双链寡核苷酸解链温度值的孔与孔之间的差异，对 于每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度。
[0042] 在一个实施方案中，所述特定靶核酸包含单核苷酸多态性（SNP)。在另一个实施方 案中，所述特定靶核酸包含多于一个SNP。SNP是不同样品中对应核酸片段之间的点突变。 与不显示出相同SNP的另外一个样品（例如参考样品）相比，这种SNP将样品中所包含的核 酸片段的解链温度改变一个确定的值。带有或不带有SNP的对