一种利用浮萍发酵生产丁二酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用浮萍发酵生产丁二酸的方 法。
【背景技术】
[0002] 丁二酸，又称琥珀酸（succsinic acid)，是一种常见的天然有机酸，是生物进行 TCA循环的中间产物之一，广泛存在于动、植物和微生物体内。丁二酸是一种重要的有机合 成中间体，被美国FDA认定为GRAS，一般认为安全，主要应用于医药、食品、染料、生物降解 塑料、表面活性剂、动物饲料添加剂、植物生长刺激剂、洗涤剂和绿色溶剂等领域。
[0003] 目前，丁二酸生产主要是利用化学合成的方法，从丁烷通过顺式丁烯二酐（马来 酸酐），然后进行电解还原反应，生成丁二酸。以化学方法生产丁二酸，不仅底物顺式丁烯二 酐和催化剂的成本较高，而且需要消耗大量不可再生的石化原料，环境污染严重，从而限制 了丁二酸的广泛应用。
[0004] 与传统的化学合成法相比，微生物发酵生产丁二酸具有发酵法具有环境友好性、 可利用废弃的生物质资源等优点，而且开辟了固定温室气体C0 2应用的新途径。目前，通 过发酵法生产得到的琥泊酸，其价格大约为0. 55~1. l$/kg。另外，据Bio-amber公司 称，琥珀酸具有25亿欧元的市场，且生物法生产琥珀酸能够与石化的方法相竞争，并计划 于2011前利用植物作为原料进行工业生产琥珀酸。丁二酸是许多严格厌氧菌和兼性厌 氧菌代谢的重要中间产物。目前人们已经发现多种微生物可以通过发酵来生产琥珀酸， 其中研宄主要集中在产琥泊酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes)和大肠杆菌 (E. coli)。此外，曼海姆产瑭I自酸菌（Mannheimia succiniciproducens)，产瑭I自酸厌氧螺 菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens)和一些乳酸菌、丙酸产生菌及真菌等也可 以产生少量的丁二酸。在众多的产琥珀酸微生物中，产琥珀酸放线杆菌能够利用多种糖类 进行发酵，并且可以耐受葡萄糖和琥珀酸的浓度分别高达158g/L和104g/L ;同时，该菌以 其高产量、高耐受性等优势，成为最具发展前景的琥珀酸产生菌之一。
[0005] 目前，有关发酵生产丁二酸的所用的原料除葡萄糖外，主要为粮食原料，如美国 Argonne 实验室进行 了玉米生产丁二酸石开宄(www.ipd.anl.gov/biotech/index.html, 2002)，日本味之素和三菱化学公司共同联合开展以玉米淀粉为原料发酵生产丁二酸的研 宄(http://www. bio!68. com, 2005)〇但由于近几年粮食原料的生物工业的蓬勃发展，粮食 出现短缺，价格上涨趋势明显，此外过度依赖粮食也会影响国家的粮食安全，所以使用价格 低廉的非粮原料进行丁二酸发酵是降低丁二酸生产成本及产业化的关键。
[0006] 非粮原料生产丁二酸研宄国内外有一些报道，韩国Lee PC报道了以Manheimia succiniciprducens MBEL55E发酵乳清原料生产丁二酸，日本科学家Inui等利用纤维素水 解液生产丁二酸，江南大学孙志浩等人以糖蜜、芭蕉芋等原料进行了发酵丁二酸研宄，南京 工业大学姜岷及合肥工业大学姜绍通课题组对纤维素原料生产丁二酸进行报道，广西科学 院黄日波等以木薯为原料产丁二酸进行了研宄。目前，以浮萍为原料生产丁二酸的研宄还 未见报道。
[0007] 浮萍（duckweed)为单子叶水生植物，它属单子叶植物纲，天南星目，浮萍科，常用 于污染水体的净化，这主要是源于它可以通过根或叶状体从水中吸收所需的氮磷等营养物 质供自身生长，同时达到净化水体的目的。浮萍的营养成分也非常丰富，富含蛋白质，纤 维含量低，淀粉含量在25%左右，个别浮萍种的蛋白含量高达75% (Klass D L. Duckweed Plants for Waste-water Reuse and Biomass Production[M]. Chicago:Institute of Gas Technology，1993:423-432.)。浮萍具有淀粉含量高、生长速度快、易于培养、材料 成本低、不占用耕地、不与人争粮等优点。此外，浮萍中蛋白质含量高达30%以上，浮萍 中蛋白质年产量可高达2000kg/hm 2,而大豆、大米和玉米蛋白质年产量分别为300、70和 180kg/hm2 (Bhanthumnavin, K. and M. G. McGarry. Wolffia arrhiza as a possible source of inexpensive protein. Nature (letter) ,1971，232:495.)。而用于丁二酸发酵的产瑭 珀酸放线杆菌自身合成B族维生素和氨基酸的能力有限，对氮源的要求很高（McKinlay JB,Zeikus JG, Vieille C. Insights into Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism in a chemically defined growth medium[J]. Applied Microbiology and Bi otechnology, 2005, 71 (11) :6651-6656)，而浮萍富含蛋白，可以降低氮源的添加量，有利于 降低生产成本。目前关于利用浮萍制备燃料乙醇、丁醇、L-型乳酸和生物柴油的报道已经 有较多报道，但是利用它为原料发酵产丁二酸的研宄未见报道。
[0008] 浮萍是污水处理生态工程中重要的水生植物类群，它在净化污水的同时会大量繁 殖，其巨大的数量，如果不能及时处理，也将造成水体的二次污染。因此，丁二酸发酵的以浮 萍为原料与污水治理耦合进行，净化了水体的同时又为丁二酸发酵提供了优良的原料。因 此，该技术具有广阔的发展前景。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对现在丁二酸发酵生产中原料成本过高的问题，提供一种 利用浮萍发酵生产丁二酸的方法，以廉价的非粮原料浮萍为底物，以产琥珀酸放线杆菌 (Actinobacillus succingenes)为菌种发酵生产丁二酸，既降低丁二酸生产成本，又实现 废水资源化、环保化。
[0010] 本发明的技术方案是：一种利用浮萍发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：
[0011] 1)浮萍原料的粉碎与调浆：将于70°C烘干至恒重的浮萍进行粉碎过60目筛，加水 调节总糖浓度至30-70g/L，得到浮萍醪液；
[0012] 2)发酵培养及制备：将浮萍醪液的pH值调节为5. 5,加入中温a -淀粉酶，85°C水 解30min，降温调节pH值为4. 5,加入糖化酶60°C水解2h，加入所需氮源、无机盐、pH缓冲 剂，115°C灭菌20min备用；
[0013] 3)种子液的制备：将平板上的产琥J白酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes)接入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养16-20h，再按照5% (V/V)接种量 进行二级扩繁培养8h，即得到液态种子；
[0014] 4)接种和发酵：按5-10% (V:V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，同时 加入0. 22 y m滤膜过滤的中性蛋白酶0. 5g/L，在充满队或C0 2的环境中发酵，利用pH缓冲 剂调节发酵pH维持在5. 5-7. 0,并在30-38°C发酵30-60h，最后通过高效液相色谱检测丁 二酸含量，所述发酵培养基为：浮萍淀粉水解液总糖30-70g/L，氮源0-20g/L，KH2P0 42g/L， CaCl20. 3g/L，MgCl20. 3g/L，pH 缓冲剂是 20-60g/L。
[0015] 所述的发酵培养基中添加氮源为玉米浆，酵母粉，大豆粉，花生饼粉中的一种或几 种。
[0016] 所述的pH缓冲剂是碱式碳酸镁或碳酸钠。
[0017] 本发明的突出优点和有益效果：
[0018] 1、以浮萍为原料发酵生产丁二酸，丁二酸浓度可达30_55g/L，糖的利用率为 85 % -92 %，生产强度达到 0? 73-1. 46gAL ? h);