[0019] 2、利用廉价的浮萍替代昂贵的葡萄糖或粮食作物为原料发酵生产丁二酸，一方面 能节约大量粮食，保障我国的粮食安全，同时可减少氮源添加量，降低丁二酸生产成本；另 一方面可消耗掉大量浮萍，防止过度生长造成的水体二次污染，实现废水资源的环保化；
[0020] 3、利用可再生生物质资源生产丁二酸，还可缓解化学合成丁二酸的石化资源紧张 问题，而且对环境友好。
【附图说明】
[0021] 图1是本发明所述的1. 3L发酵罐分批发酵浮萍产丁二酸结果。
【具体实施方式】
[0022] 以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0023] 实施例1
[0024] 本实施例为本发明所述的利用浮萍发酵生产丁二酸的方法的具体实例，包括如下 操作步骤和控制技术条件：浮萍原料采自广西壮族自治区南宁市兴宁区。
[0025] 1、浮萍原料的粉碎与调浆：将于70°C烘干至恒重的浮萍进行粉碎，过60目筛，加 水调节总糖浓度至30-70g/L，得到一种浮萍醪液；
[0026] 2、发酵培养及制备：将浮萍醪液的pH值调节为5.5,按10u/g浮萍粉加入中温 a -淀粉酶，85°C水解30min，降温调节pH值为4. 5,按105u/g浮萍粉加入糖化酶，60°C水 解 2h，加入玉米浆 0-20g/L、KH2P042g/L，CaCl20. 3g/L，MgCl20. 5-lg/L，碱式碳酸镁或碳酸钠 20-60g/L，115°C灭菌 20min 备用；
[0027] 3、种子液的制备：将平板上的产琥泊酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes)接入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养16-20h，再按照5% (V/V)接种量 进行二级扩繁培养8h，即得到液态种子。种子培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L， 玉米浆 4g/L，NaHC034g/L，NaH2P049. 6g/L，K2HP041. 55g/L。
[0028] 4、接种和发酵：按5-10% (V/V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，同时 加入滤膜过滤的中性蛋白酶，在充满队或C0 2的环境中发酵，利用pH缓冲剂调节发酵pH维 持在5. 5-7. 0,并在30-38°C发酵30-60h，即可得到丁二酸。所述发酵培养基为：浮萍淀粉 水解液总糖 30-70g/L，氮源 0-20g/L，KH2P042g/L，CaCl20. 3g/L，MgCl20. 3g/L，pH 缓冲剂是 20-60g/L〇
[0029] 所述的产瑭泊酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes)GXAS137,为本实验从 肉牛瘤胃中筛选获得，于2011年11月18日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中 心，保存编号为CCTCC M 2011399,中国专利CN102851224A已公开。
[0030] 所述的pH缓冲剂是20-60g/L的碱式碳酸镁或碳酸钠。
[0031] 分析方法：
[0032] 样品处理：发酵液在室温下12000r/min，离心10min，取上清，然后用孔径为 0. 22 ym的无菌滤膜过滤，用高效液相色谱（HPLC)检测发酵液丁二酸及残还原糖浓度。
[0033] 有机酸测定：HPLC法，戴安Utimat3000,自动进样器，色谱柱：Rezex ROA-organic acid300X7. 8mm，流动相 2. 5mmol/L H2S04，pH2. 5,柱温 45°C，进样量 10uL，流速 0? 6mL/min， 紫外检测器波长210nm。
[0034] 残还原糖测定：3, 5-二硝基水杨酸法（DNS)，测定时以葡萄糖为标准物质。
[0035] 残总糖测定：采用酸水解后测定还原糖含量，测定时以葡萄糖为标准物质。
[0036] 生物量测定：米用分光光度计（DU 800UV/VIS Spectrophotometer, Beckman, USA) 在660nm进行测定，样品先用0. 2M HC1进行处理，溶解所含的MgC03，12000r/min离心 l〇min，再用蒸馏水洗三次，以除去所含的色素及杂质。
[0037] 丁二酸产率（％ )定义为每消耗lg葡萄糖所产生丁二酸的克数。
[0038] 实施例2
[0039] 将产琥珀酸放线杆菌菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱或普通培养箱中37°C 静止培养16h，再按照5% (V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到液态种子。按8% (V/ V)的接种量接入装有发酵培养基的250mL三角瓶中，装液量为150mL，添加20g/L的玉米浆 作为氮源，添加50g/L的碱式碳酸镁调节pH在6. 0-7. 0,置于厌氧培养箱中37 °C发酵60h。 厌氧箱培养条件：厌氧箱 G)〇n Whitley Scientific DG250anaerobic workstation)，混合 气 N2:C02:H2= 8. 5 :1.0 :0. 5,温度 37°C。实验结果如表 1。
[0040] 表1不同总糖浓度浮萍对丁二酸产量的影响
[0041]
【主权项】
1. 一种利用浮萍发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 1) 浮萍原料的粉碎与调浆：将于70°C烘干至恒重的浮萍进行粉碎过60目筛，加水调节 总糖浓度至30-70g/L，得到浮萍醪液； 2) 发酵培养及制备：调节浮萍醪液的pH值为5.5,加入中温a-淀粉酶，85°C水解 30min，降温调节pH值为4. 5,加入糖化酶60°C水解2h，加入所需氮源、无机盐、pH缓冲剂， 115°C灭菌20min备用； 3) 种子液的制备：将平板上的产琥泊酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes)接 入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养16_20h，再按照5% (V/V)接种量进行二级扩繁培养 8h，即得到液态种子，所述的种子培养基的成分及其浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉 米浆 4g/L，NaHC034g/L，NaH2P049. 6g/L，K2HPO4L 55g/L ; 4) 接种和发酵：按5-10% (V:V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，同时加 入0. 22 y m滤膜过滤的中性蛋白酶0. 5g/L，在充满队或CO 2的环境中发酵，利用pH缓冲 剂调节发酵pH维持在5. 5-7. 0,并在30-38°C发酵30-60h，最后通过高效液相色谱检测丁 二酸含量，所述发酵培养基为：浮萍淀粉水解液总糖30-70g/L，氮源0-20g/L，KH 2P042g/L， CaCl2O. 3g/L，MgCl2O. 3g/L，pH 缓冲剂是 20-60g/L。
2. 根据权利要求1所述的利用浮萍发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，所述的发酵 培养基中添加氮源为玉米浆，酵母粉，大豆粉，花生饼粉中的一种或几种。
3. 根据权利要求1所述的利用浮萍发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，所述的pH缓 冲剂是碱式碳酸镁或碳酸钠。
【专利摘要】一种利用浮萍发酵生产丁二酸的方法。包含以下步骤：将浮萍烘干，粉碎后加水调浆，利用α-淀粉酶和糖化酶水解浮萍所含的淀粉释放出可发酵性糖类作为碳源，添加一定量蛋白酶水解浮萍所含蛋白质，可作为氮源，并添加所需营养物质及pH调节剂，灭菌后即可作为发酵培养基，在无菌的条件下加入培养好的产琥珀酸放线杆菌种子，放入厌氧培养箱进行培养发酵得到丁二酸。本发明开发了一种新型能源植物浮萍来生产丁二酸的方法，不仅解决了浮萍在污水净化过程中因大量繁殖而可能导致的二次污染，而且也为丁二酸的生物炼制提供了廉价的可再生的原料来源，对环境友好，可缓解化学合成丁二酸的石化资源紧张问题。
【IPC分类】C12P7-46, C12R1-01
【公开号】CN104846021
【申请号】CN201510294395
【发明人】申乃坤, 王青艳, 廖思明, 朱绮霞, 朱婧, 秦艳
【申请人】广西科学院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年6月2日