一株久留里伯克霍尔德菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株久留里伯克霍尔德菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 氮、磷、钾是植物生长所必需的三大营养元素，而我国大多数土壤中氮、磷、钾含量 均较低。土壤中的磷主要以磷酸盐的形式存在，而钾主要以矿物形态存在于钾长石和云母 中，植物均难以吸收利用。长期以来，为了确保农产品获得高产，人们大量使用化学肥料和 农药，这样既造成了土壤结构的破坏及环境的污染，又不利于农业的可持续发展。通过微生 物的作用将空气中游离的氮转为氨以及提高土壤中难溶态磷与钾的有效性，供植物吸收利 用，从而促进作物的生长是微生物技术领域的研宄方向之一。目前，国内外有关固氮菌、解 磷菌及解钾菌的研宄较多，但兼具高效溶磷解钾性能及高固氮酶活性的菌株少有相关文献 报道。
[0003] 伯克霍尔德菌是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌。伯克 霍尔德氏菌属的一些细菌具有生物防治、促进植物生长和生物修复等功能。伯克霍尔德菌 能产生多种具有抗菌活性的代谢产物如铁载体、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱、 Cepaciamide A、CepacidineA、Cepacin A等，现已应用于生物防治，分解有毒物质等领域， 但还未发现同时具有固氮、溶磷解钾功能的伯克霍尔德菌。
[0004] 从环境中筛选具有高效溶磷解钾内生固氮的菌株，应用于种植作物的土壤中，使 菌株通过将空气中游离的氮转为氨以及提高土壤中难溶态磷与钾的有效性，供植物吸收利 用，对促进作物生长具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株久留里伯克霍尔德菌菌株 yyOl，所述菌种具有高效的溶磷解钾性能及高固氮酶活性。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种上述菌株的应用。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述菌株在促进作物生长方面的应用。
[0008] 本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现。
[0009] 一株久留里伯克霍尔德氏菌（ifcrAAo/oferia AtfTtfriefl1Si1SOyyOl,所述菌株于2015 年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，菌种保藏 号为 CGMCC No. 10631。
[0010] 所述菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 所述菌株呈短杆状，最适生长温度为37°C，最佳生长pH6~8，耐NaCl的浓度达 3. 0%，分泌过氧化氢酶及脲酶；所述菌株对300 μ g/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素 及50 μ g/mL的四环素均具有耐受性。所述菌株在LB琼脂平板上生长速度较快，在37°C，生 长36小时后，菌落呈圆形凸起，米黄色不透明，菌落直径3-6毫米。所述菌株兼性厌氧，甲 基红反应呈阳性，V. P反应呈阴性，过氧化氢酶阳性，不能液化明胶及水解淀粉；D引哚反应 呈阳性，且能分泌生长素 IAA ;具有产氨能力，能分泌脲酶。5 μ g/mL的拉霉素、庆大霉素、链 霉素能抑制该菌株的生长。
[0012] 所述菌株的应用；所述应用指溶磷、解钾或固氮中的一种或多种。
[0013] 优选地，将所述菌株用于制备溶磷解钾及兼具固氮酶活性的接种剂。
[0014] 优选的，将所述菌株用于制备生物肥。
[0015] 所述菌株在促进作物生长方面的应用。所述菌株具有溶磷解钾及固氮特性，能分 泌生长素 IAA，以及过氧化氢酶及脲酶，具有产氨能力，能够为作物生长提供营养物质；同 时，所述菌株耐NaCl的浓度可达3%，对300 μ g/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素及 50 μ g/mL的四环素均具有耐受性，对环境的适应性和耐逆性较强。优选地，所述作物为水稻 或烟草。
[0016] 优选地，将所述菌株制成菌悬液施于作物根部。
[0017] 优选地，所述作物为水稻，并将所述菌株制成浓度为IO8细胞/mL的菌悬液施于水 稻根部。为显著提高水稻的高度、根长、分蘖数、鲜重、干重和根重，更优选地，将所述菌悬液 施于水稻根部后，培养一段时间后补充一次所述菌悬液，培养时间共计达35d。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： (1)本发明筛选获得一株久留里伯克霍尔德菌yyOl，兼具 高效溶磷解钾和较高固氮酶活性，菌株通过提高土壤中难溶态磷与钾的有效性以及能将空 气中游离的氮转为氨，供作物吸收利用，对水稻、烟草等农作物有着明显的促生作用。
[0019] (2)筛选得到的久留里伯克霍尔德菌yyOl生长速度快，对环境适应性和耐逆性较 强，能够促进并调节植物的生长。所述菌株能分泌生长素 IAA，以及过氧化氢酶及脲酶，具 有产氨能力，耐NaCl的浓度可达3%，对300 μ g/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素及 50 μ g/mL的四环素均具有耐受性。
【附图说明】
[0020] 图1为菌株yyOl的16S rRNA基因序列系统发育树。
[0021] 图2为菌株yyOl溶磷解钾定性试验；注：A为磷透明圈；B为钾透明圈。
[0022] 图3为菌株yyOl固氮酶nifH基因的扩增结果。
[0023] 图4为菌株yyOl接种中嘉早17号的生长情况；注：CK为对照组；yyOl为接种菌 株yyOl的实验组。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。以下实施例为本 发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明主要阐述所 述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘 述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修 饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。
[0025] 实施例中钾选择培养基组分为：葡萄糖10. 0g，Na2HPO4 0. 2g，MgSO4 · 7H20 0. 2g， NaCl 0.2g，CaS04.2H20 0.2g，CaC03 5.0g，钾长石粉（200 目）2.5g，琼脂 15.0 g，去离子水 1000mL，pH 7. 2。其他培养基如LB、CCM、NFb和PKO培养基的组分均为本领域技术人员所 公知。
[0026] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设 备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0027] 实施例1伯克霍尔德菌yyOl的获得 药用野生稻由于长期处于野生状态，经受了各种灾害和环境的自然选择，从而使它具 有抗病虫害、抗旱、耐贫瘠土壤等特性，发明人将广西药用野生稻作为材料，从中分离筛选 出久留里伯克霍尔德菌yyOl。
[0028] 分离纯化：取广西药用野生稻用蒸馏水洗净，剪下长度3~5cm的根、茎、叶分别置 于已灭菌的3个培养皿中，用70%乙醇浸泡5min，再用0. 1%的HgCl2浸泡3min，无菌水洗涤 7次，每次8min，并将最后一次洗涤液涂布于LB固体培养基上，以检测表面消毒是否彻底。 将表面消毒完全的根、茎、叶用灭菌剪刀剪碎，分别用灭菌镊子夹入到3支装有CCM及3支 装有NFb的半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于37°C的细菌培养箱内进行培养。待试 管中长出菌体后，向管内注入1/10体积10%乙炔气体，其终浓度为1%，12h后，测定固氮酶 活性，将有固氮酶活性的菌种再次平板划线分离，37°C继续培养。再次挑取单菌落分别接种 至相应的半固体培养基中，利用乙炔还原法检测固氮酶活性，没有活性的菌株舍弃，有活性 的菌株继续平板划线直到获得纯的菌株，最后通过镜检，石炭酸复红染色，进一步观察其形 态确定是否纯化。纯化后的菌株于15%的甘油中-20°C保存。共获得73株具有内生固氮功 能的菌株，分别编号yy〇l~73。
[0029] 筛选：将