分离纯化得到的菌株活化后，进行溶磷解钾定性试验，即用无菌水制成浓 度为IO 8细胞/mL的菌悬液，吸取10 μ L菌悬液点植于PKO及钾选择培养平板的中间，于 37°C细菌培养箱中培养48h，观察有无透明圈生成，测定透明圈直径（D)、菌落直径（d)。筛 选出在PKO及钾选择培养平板中D/d比值均大于2的菌株，结果筛选到1株菌株yyOl，它在 PKO及钾选择培养基上具有高效溶磷解钾能力。
[0030] 因此，菌株yyOl是具有高效溶磷解钾及固氮酶活性的菌株。
[0031] 保存：将分离纯化后的菌株yyOl在LB平板上培养1-2 d后，收集平板上的菌体。 保存于15%灭菌甘油（-20 °C )。
[0032] 实施例2伯克霍尔德菌yyOl的鉴定 菌株yyOl呈短杆状，最适生长温度为37°C，最佳生长pH6~8，耐NaCl的浓度达3. 0%，分 泌过氧化氢酶及脲酶。所述菌株在LB琼脂平板上生长速度较快，在37°C，生长36小时后， 菌落呈圆形凸起，米黄色不透明，菌落直径3-6毫米。通过生理生化特性测定，显示该菌兼 性厌氧，甲基红反应呈阳性，V. P反应呈阴性，过氧化氢酶阳性，不能液化明胶及水解淀粉； 吲哚反应呈阳性，且能分泌生长素 IAA ;具有产氨能力，能分泌脲酶。所述菌株pH生长范围 较小，可耐pH6~8，耐NaCl的浓度可达3% ;对300 μ g/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉 素及50 μ g/mL的四环素均具有耐受性；而5 μ g/mL的拉霉素、庆大霉素、链霉素便能抑制该 菌株的生长。
[0033] 所述菌株采用细菌16S rRNA基因通用引物25f和1492r进行扩增，将其PCR产 物直接进行序列测定，结果如SEQ ID NO: 1所示。将获得的序列输入GenBank进行BLAST 比对，将相似性相近的序列采用邻接法（neighbor-joining method)进行聚类分析并构建 系统发育树，结果见图1。初步确定本发明的菌株yyOl在分类学中的种、属的位置，结果发 现本发明的菌株yyOl与久留里伯克霍尔德菌（及模式菌株DSM 13646相似性为99. 4%。
[0034] 因此，通过形态学特征，生理生化特性及16S rRNA序列分析，菌株yyOl鉴定为伯 克霍尔德氏菌tortfrieflsis)。将所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏日期是2015年3月17日，保藏号是CGMCC No. 10631， 所述菌株分类命名为久留里伯克霍尔德氏菌菌株的保藏单位 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0035] 实施例3伯克霍尔德菌yyOl的溶磷解钾及固氮性能实验 取菌株yyOl进行溶磷解钾能力的测定。将菌株分别接种至PKO和钾选择培养平板上， 通过透明圈法进行溶磷解钾定性试验，结果见图2,菌株yyOl能形成非常明显的透明圈，溶 磷比值为2. 92,解钾比值为4. 13。再以rariicoh作为参比菌株，通过钼锑 抗比色法及四硼酸钠法进行溶磷解钾定量试验，结果见表1，显示菌株yyOl溶无机磷量达 116. 28 mg/L，是参比菌株 rariico/a的 2. 73 倍；解钾量达 268. 31 mg/L，是参 比菌株 的 4. 67 倍。
[0036] 表1菌株yyOl与参比菌株rariico/a的溶磷解钾能力
注：D为透明圈直径，d为菌落直径；D/d的比值越大，菌株溶磷解钾效果越好。
[0037] 取菌株yyOl进行固氮酶活性的测定及固氮酶/7iiH基因扩增。利用乙炔还原法测 得菌株yyOl的固氮酶活性为8. 78 Um0IC2H4^mr1 · 1Γ1，固氮酶活性较高。利用Zehr J P 设计的引物扩增基因片段，在分子水平上通过PCR技术检测菌株yyOl是否存在固氮 酶/?iiH基因。PCR反应条件：97°C预变性3 min，97°C变性lmin，55°C复性50 s，72°C延伸 358,32个循环，反应完成后，72°0延伸5 11^11，结果发现成功扩增出约36(^?的固氮酶/^相 基因片段，结果见图3。
[0038] 通过研宄发现，本发明筛选获得的久留里伯克霍尔德菌及/r狀Weria yyOl，兼具高效溶磷解钾和较高固氮酶活性。
[0039] 实施例4伯克霍尔德菌yyOl对水稻的促生效果试验 实验材料：水稻中嘉早17号，2012年10月采自广西省梧州市长洲区倒水镇。
[0040] 采用盆栽法把菌株yyOl回接至水稻中嘉早17号：首先，将菌株活化好，以保证在 对数生长期内，然后制成浓度为IO 8细胞/mL的菌悬液，浸泡有12d苗龄的水稻苗根部36h。 再将水稻苗分别转接到装有540g水稻土的1000 mL塑料大杯中，每个塑料大杯中加入50mL 植物无氮营养液，实验组再加入上述菌悬液30 mL，设置对照，对照组为用等量无菌水替换 菌悬液。实验组和对照组均设置3个重复，放室温下同等条件进行培养，每天及时观察、添 加水。培养观察至20d后，实验组再次加入上述菌悬液30mL及50mL植物无氮营养液，对照 组加入30mL无菌水及50mL植物无氮营养液。继续培养观察至15d后拍照记录，并测定水 稻的高度、根长、分蘖数、鲜重、干重、根重，结果见图4和表2。
[0041] 试验结果表明菌株yy〇l接种水稻之后，与没有接种菌株的对照相比水稻的叶长、 根长、鲜重、根重都达到了显著差异，对水稻有明显的促生作用。其中叶长增加了 25. 9%，根 增长了 42. 3%，分蘖数增加了 79. 64%，鲜重增加了 166. 9%，干重增加了 73. 7%，根重增加了 122. 2%〇
[0042] 表2菌株yyOl接种水稻后的促生效果
【主权项】
1. 一株久留里伯克霍尔德氏菌（ifcrAAo/oferiayyOl，其特征在于，所 述菌株于2015年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，菌种保藏号为CGMCCNo. 10631。2. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16SrRNA序列如SEQIDNO: 1 所示。3. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株呈短杆状，耐NaCl的浓度达 3. 0%，分泌过氧化氢酶及脲酶；所述菌株对300yg/mL氨苄青霉素、氯霉素、新霉素、红霉素 及50yg/mL的四环素均具有耐受性。4. 权利要求1所述菌株的应用；所述应用指溶磷、解钾或固氮中的一种或多种。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述菌株用于制备溶磷解钾及兼具固 氮酶活性的接种剂。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述菌株用于制备生物肥。7. 权利要求1所述菌株在促进作物生长方面的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述菌株制成菌悬液施于作物根部。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述作物为水稻，并将所述菌株制成浓度 为IO8细胞/mL的菌悬液施于水稻根部。
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，具体公开了一株久留里伯克霍尔德氏菌及其应用。所述菌株为久留里伯克霍尔德氏菌（Burkholderia kururiensis）yy01，所述菌株于2015年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏号为CGMCC No.10631。菌株yy01兼具高效溶磷解钾和较高固氮酶活性，菌株通过提高土壤中难溶态磷与钾的有效性以及能将空气中游离的氮转为氨，供作物吸收利用，对水稻、烟草等农作物有着明显的促生作用。CGMCC NO.1063120150317
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/01, A01P21/00, B09C1/10, A01N63/02
【公开号】CN104911122
【申请号】CN201510171613
【发明人】谭志远, 阳洁, 彭桂香
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年4月13日