在蓝藻中生产1,3-丙二醇的制作方法
【专利说明】在蓝藻中生产1,3-丙二醇
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2012年10月18日提交的美国临时专利申请序列号61/715, 371的权 益，其公开的内容通过提述并入本文。
[0003] y步及序列表
[0004] 本申请包含序列表，其通过EFS-Web提交，于2013年10月11日生成，名称为 "PropanedioHS-PCI^seqJist-STSS"，大小为 102KB。 发明领域
[0005] 本发明涉及经修饰以产生有用化学品如1，3-丙二醇的蓝藻宿主细胞。
[0006] 发明背景
[0007] 蓝藻/蓝细菌（cyanobacteria)(也称作"蓝绿藻"）是小的、主要为水生的原 核细胞，其具有进行产氧光合作用，并从输入的光、营养物质和CO 2制造生物质和有机化 合物的能力。蓝藻能够经遗传增强以产生有价值的产物，如生物燃料、药物、营养食品 等。例如，已描述了用编码特定酶的基因转化蓝藻聚球藻属（Synechococcus)可产生用 于生物燃料生产的乙醇（授予Woods等的美国专利号6, 699, 696和6, 306, 639)。在例如 PCT/US2007/001071、PCT/EP2009/000892 和 PCT/EP2009/060526 中描述了蓝藻集胞藻属 (Synechocystis)的转化。
[0008] 化合物1，3_丙二醇是一种粘稠、无色、可与水混溶的液体。1，3_丙二醇可被用 作生产聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET)、尼龙、和PET变异体聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT) 的构建块（building block)。1,3-丙二醇也可用于多种材料中，包括粘合剂、层压板 (laminates)、服装（clothing)、地毯、塑料、涂料、模制品（moldings)、防冻剂、脂肪族聚醋 和共聚酯。
[0009] 1，3-丙二醇可以合成产生或者通过发酵产生。已经有多种不同的1，3-丙二醇合 成制造方法被采用。例如，1，3-丙二醇可由下述合成产生：1)在膦、水、一氧化碳、氢和酸的 存在下，由环氧乙烷在催化剂上产生；2)通过丙烯醛的催化溶液相水合随后进行还原；或 3)在一氧化碳和氢的存在下，由碳氢化合物（如甘油）在具有来自周期表第VIII族的原子 的催化剂上反应产生。
[0010] 美国专利号5, 786, 524教导了从环氧乙烷制备1，3-丙二醇。该过程涉及（1)钴 催化环氧乙烷加氢甲酰化（与合成气、H2/C0反应）以制备中间产物3-羟基丙醛（HPA)的 稀释溶液；（2)将HPA提取到水中形成更浓缩的HPA溶液；和（3)将HPA氢化为丙二醇。 [0011] 美国专利申请公开号20110125118描述了从丙烯酸合成生产1，3-丙二醇的方法 的一个预示实例（prophetic example)。该方法包括在无支持物的（unsupported)钌催化 剂的存在下，使用搅拌反应罐在1000 psi和150°C使3-羟基丙酸在液相（水和环己烷）中 加氢。
[0012] 在例如美国专利号5, 686, 276、美国专利号6, 358, 716和美国专利号6, 136, 576中 描述了使用重组工程化细菌通过糖和甘油发酵而生物法产生1，3-丙二醇。
[0013] 美国专利号8,216,816描述了可用于在微生物中产生1，3-丙二醇的生物 工程方法的预示性实例。预示方法利用如下的生物学途径：酶sn-甘油-3-P脱氢酶 darl(ECl. I. 1 ;酿酒酵母（S. cerevisiae)来源）从二羟基丙酮-P、NADH和NADPH产生 sn-甘油-3-P。酶sn-甘油-3-磷酸酶gpp2(EC 3. 1. 3. 21 ;酿酒酵母来源）从sn-甘油-3-P 产生甘油。酶甘油脱水酶dhaBl-3 (EC 4. 2. 1. 30 ;肺炎克雷伯氏菌（K. pneumonia)来源）从 甘油产生3-羟基丙醛。酶1，3-丙二醇氧化还原酶dhaT (EC I. I. 1. 202 ;肺炎克雷伯氏菌 来源）将3-羟基丙醛和NADH转化成1，3-丙二醇。
[0014] 目前生产1，3-丙二醇的方法需要输入有机碳源，如石化燃料（fossil fuel)或 糖。本发明的一个目的是从CO2作为输入碳源，而不是从石化燃料或从其它有机起始原料 生产这些化合物的方法。
【发明内容】
[0015] 在本发明的一个方面中，提供了用于在蓝藻中生产1，3-丙二醇的遗传增强的核 酸序列，其具有至少一个能够在蓝藻中调苄基因表达的启动子，和DAR1、GPP2、dhaBl-3、 orfZ、orf2b和yqhD基因。所述核酸序列能够在蓝藻细胞中复制。至少一个基因可存在于 质粒上，例如外源的或内源的质粒，或者它可存在于蓝藻染色体上。启动子可为例如Psrp、 PnblA712(l、PrbcL_、PsmtA7cici2、和 ZiaR-PziaA68tl3。在一个实施方案中，启动子序列可为，例 如，SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4 或 SEQ ID N0:5。
[0016] 编码DARl的基因可与SEQ ID N0:6具有至少98%的同一性。DARl多肽可与SEQ ID N0:7具有至少98%的同一性。编码GPP2的基因可与SEQ ID N0:8具有例如至少98% 的同一性。GPP2多肽可与SEQ ID N0:9具有至少98%的同一性。dhaBl-3编码核酸序列 可与SEQ ID NO: 10具有至少98%的同一性。dhaBl-3核酸序列能够编码三个分离的多肽， DhaBl、DhaB2和DhaB3,其中DhaBl多肽可与SEQ ID勵：12具有至少98%的同一性，01^82 多肽可与SEQ ID N0:14具有至少98%的同一性，而DhaB3多肽可与SEQ ID N0:16具有至少 98%的同一性。orfZ和orf2b核酸序列可与SEQ ID NO: 17具有至少98%的同一性。orfZ 基因可编码与SEQ ID NO: 19具有至少98%的同一性的多肽，并且其中orf2b基因可编码 与SEQ ID NO:21具有至少98%的同一性的多肽。yqhD基因可与SEQ ID NO:22具有至少 98%的同一性。YqhD多肽可与SEQ ID N0:23具有至少>98%的同一性。
[0017] 在本发明的另一个方面中，提供了遗传增强的蓝藻细胞，其具有DARl基因、GPP2 基因、dhaBl-3的核酸序列、orfZ基因、orf2b基因和yqhD基因，其中该细胞可产生1，3-丙 二醇。所述蓝藻可为例如集胞藻属菌种PCC6803或聚球藻属菌种PCC 7002。
[0018] 在本发明的另一个方面中，提供了一种在蓝藻细胞内产生1，3-丙二醇的方法， 其通过向蓝藻细胞引入核酸序列，其具有编码DARl酶的基因、编码GPP2酶的基因、编码 DhaBl-3酶的基因、编码OrfZ酶的基因、编码0rf2b酶的基因和编码YqhD酶的基因；然后 在产生1，3-丙二醇的条件下培养所述细胞。
[0019] 附图简沐
[0020] 图1是用于从中心碳代谢物磷酸甘油酮（DHAP)生产1，3-丙二醇的生物合成途径 的图。当将这个途径中的基因转移到蓝藻时，这些代谢物能够通过光合成和糖异生途径使 用CO 2为输入碳源来产生。
[0021] 图2是广宿主范围RSF1010来源的质粒PSL1211中的基因和相关特征的线性图， 该质粒用作本文所述表达载体的基础。指示了相关的限制位点和终止子区（TT)。
[0022] 图3是pSL1211来源质粒（〃pABb〃）的线性化图，其用作插入实施例4中所述丙二 醇基因的框架质粒。指示了启动子、终止子（TT)、和核糖体结合位点（RBS)。
[0023] 图4是含有如实施例4所述的参与1，3-丙二醇产生的基因编码区的核酸区段的 线性化图。
[0024] 图5是色谱迹线的重叠 （overlay of chromatograph trace)，其确认1，3_丙二醇 途径的起始部分的基因表达和从磷酸甘油酮成功转化为甘油。迹线显示携带质粒ρΑΒΙΟΟΙ 的集胞藻属菌种PCC 6803能够产生中间产物甘油。还显示了集胞藻属菌种PCC 6803野生 型和100 μ M甘油标准物。迹线是在Dionex系统上使用液相色谱分离甘油产生的。将保 留时间为8. 1分钟的峰鉴定为甘油。
[0025] 图6是来自携带质粒ρΑΒ1003的聚球藻属菌种PCC 7002的5Χ浓缩的甲醇/磷酸 盐提取物的图片。迹线是使用气相色谱分离1，3-丙二醇产生的。峰用质谱鉴定。将保留 时间为5. 88分钟的峰鉴定为1，3-丙二醇。该峰不存在于野生型聚球藻属菌种PCC 7002 中。
[0026] 发明详沐
[0027] 蓝藻宿主细胞被遗传增强以产生各种有价值的化学产物，例如1，3-丙二醇。在一 个实施方案中，参与1，3-丙二醇生物合成途径的基因可被转移到蓝藻宿主细胞中。插入的 异源基因可存在于染色体外的质粒上，或者它们可存在于蓝藻染色体上。然后，蓝藻按照一 般的蓝藻方法进行培养，并在适当的时候移出丙二醇。在蓝藻中而不是通过使用化学手段 生产1，3-丙二醇，允许以二氧化碳作为初始碳源而不是从原油或其它有机碳源生产该化 合物。
[0028] 本发明的方面利用分子生物学、微生物学和细胞培养领域常用的技术和方法。关 于这些类型的方法的有用实验室参考对于本领域的技术人员是容易获得的。参见，例如 Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第三版），Sambrook, J 等（2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Current Protocols in Microbiology(2007)Coico, R 等 编，John Wiley and Sons,Inc. ；The Molecular Biology of Cyanobacteria(1994)Donald Bryant (编），Springer Netherlands ；Handbook Of Microalgal Culture Biotechnology And Applied Phycology(2003)Richmond，A.;(编），Blackwell Publishing;和"The cyanobacteria, molecular Biology, Genomics and Evolution"，Antonia Herrero 和 Enrique Flores编，Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2008。
[0029] 在本说明书中提到的全部出版物和专利申请通过提述并入本文，其程度如同每个 的出版物和专利申请被具体而个别地指示以通过提述并入。
[0030] 定义
[0031] 除非另外限定，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域技术 人员所公知的含义。如本文所使用的，除非另外指出，否则下列术语具有归因于它们的含 义。
[0032] 术语"大约"在本文中使用的意思是大约、在所述范围内、粗略地或周围。当术语 "大约"和数值/数值范围联合使用时，它通过延伸所提数值的上下边界对所述数值/范围 进行修饰。一般地，术语"大约"在本文中用于修饰数值高于或低于所述数值的20%的变 异。
[0033] 术语"蓝藻"是指一群光合自养原核微生物，其能够利用太阳能和固定二氧化碳。 蓝藻也被称作蓝绿藻。
[0034] 术语"宿主细胞"和"重组宿主细胞"意在包括适合于代谢操纵的细胞，例如能够并 入异源多核苷酸序列，例如可被转化的细胞。该术语意图包括最初被转化细胞的后代。在 特殊的实施方案中，所述细胞是原核细胞，例如，蓝藻细胞。术语重组宿主细胞意图包括已 经被选择或工程化从而具有某些期望的性能、并且适合于用本发明的组合物和方法进一步 增强的细胞。
[0035] "表达感受态（Competent to express) "是指细胞提供充分的细胞环境以表达内 源和/或外源多核苷酸。
[0036] 如本文所使用的，术语"遗传增强"是指野生型细胞内源基因的任何改变或者向野 生型细胞添加非内源的遗传密码，例如导入异源基因。更具体地，这些改变可以通过使用重 组DNA技术或突变人为制造。改变可涉及蛋白编码序列或非蛋白编码序列，例如调节序列 如启动子或增强子。
[0037] "多核苷酸"和"核酸"是指如下的聚合物，其包括通过磷酸二酯键连接的核苷酸单 元（核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关天然存在的结构变体和其合成的非天然存在的类 似物），相关天然存在的结构变体，和其合成的非天然存在的类似物。因此，该术语包括如下 的核苷酸聚合物，其中核苷酸和它们之间的连接键包括非天然存在的合成类似物。应当理 解，在语境需要时，当核苷酸序列用DNA序列（即A，T，G，C)代表时，它也包括RNA序列（即 八，认6,〇，其中〃矿 /代替〃1'〃。
[0038] 本发明的核