油磷酸。在一个实施方案中，DARl酶是酶分类EC#1. I. 1. 8 的成员。在一个实施方案中，DARl核苷酸序列是SEQ ID NO: 6并且DARl氨基酸序列是SEQ ID N0:7〇
[0112] 术语"甘油-3-磷酸"和"GPP2"（也称作〃YER062C〃和〃H0R2〃）是指在酵母中生 物合成甘油必需的酶。在酵母中，该酶被发现参与对各种细胞胁迫的响应，例如渗透压胁迫 和氧化胁迫（Pahlman等，J Biol Chem. 276:3555-3563 ;2001)。该酶能够催化从甘油磷酸 形成甘油。"GPP2基因"是指编码促进从甘油磷酸产生甘油的酶的基因。在一个实施方案 中，GPP2由核酸登录号#NM001178953. 1编码，并且蛋白登录号为#NP 010984. 1，来自酿酒 酵母。在另一个实施方案中，本发明提供重组光合微生物，其包括至少一种异源DNA序列， 其编码的至少一种多肽催化从底物向产物的转化，导致从甘油磷酸合成甘油。在一个实施 方案中，GPP2酶是酶分类EC#3. 1.3. 21的成员。在一个实施方案中，GPP2核苷酸序列是SEQ ID NO: 8,而GPP2氨基酸序列是SEQ ID NO: 9。
[0113] 术语"辅酶B12依赖的甘油脱水酶"是指一组3个基因，统称为〃dhaBl-3〃，其编码 参与甘油脂代谢的酶复合体，该酶复合体能够催化从甘油形成3-羟基丙醛。该酶复合体包 括三种多肽。在一个实施方案中，使用包含全部3个dhaB(dhaBl，dhaB2，dhaB3)核苷酸序 列的操纵子（SEQ ID NO: 10)。在一个实施方案中，dhaBl具有核酸序列SEQ ID NO: 11和氨 基酸序列SEQ ID NO: 12 ;dhaB2具有核酸序列SEQ ID NO: 13和氨基酸序列SEQ ID NO: 14; 和dhaB3具有核酸序列SEQ ID NO: 15和氨基酸序列SEQ ID NO: 16。
[0114] 总之，由dhaBl-3编码的三种多肽形成的酶可促进从甘油产生3-羟基丙醛。在 一个实施方案中，该基因序列是核酸登录号#CP000647. 1:3846008. . 3848700,蛋白登录号 #ABR78884. 1、ABR78883. 1 和 ABR78882. 1，来自肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种（K. pneumoniae subspecies pneumonia) (Shroeter)Trevisan(ATCC#700721，本文称作肺炎克雷伯氏菌 (K. pneumoniae)。在另一个实施方案中，本发明提供重组光合微生物，其包括至少一种异源 DNA序列，其编码的至少一种多肽催化底物向产物的转化，导致从甘油合成羟基丙醛。在一 个实施方案中，dhaBl-3酶是酶分类EC#4. 2. 1. 30的成员。
[0115] 术语"orfZ"和"orf2b"是指甘油脱水酶再激活酶。在一个实施方案中，这些基因 来自肺炎克雷伯氏菌。在一个实施方案中，使用编码orfZ和orf2b两者的人工创建的操纵 子（SEQ ID NO: 17)。在一个实施方案中，orfZ的基因序列（SEQ ID NO: 18)是核酸登录号 #CP000647. 1:3844172. 3845995,蛋白登录号是 #ABR78881. 1("甘油脱水酶激活子";SEQ ID NO: 19)。这种酶具有分子伴侣样活性，并具有从甘油脱水酶除去被破坏的辅酶M其已变 成无活性）的表观功能。在一个实施方案中，〇rf2b的基因序列（"甘油脱水酶再激活因子 小亚基〃；SEQ ID N0:20)是 JF260927. 1:6577. · 6930,蛋白序列登录号是#AEL12184. 1(SEQ ID N0:21)〇
[0116] 术语"yqhD"是指编码醇脱氢酶的基因，该酶发挥1，3-丙二醇氧化还原酶的功能。 该酶能够催化从3-羟基丙醛形成1，3-丙二醇。在一个实施方案中，该基因来自大肠杆菌。 在另一个实施方案中，该基因是核酸登录号#NC_010473. 1:3251122. . 3252285,蛋白登录号 是#￥? 001731875. 1。在另一个实施方案中，本发明提供重组光合微生物，其包括至少一 种异源DNA序列，其编码的至少一种多肽催化底物向产物的转化，导致从3-羟基丙醛合成 1，3-丙二醇。在一个实施方案中，YqhD酶是酶分类EC#1. 1.1. 202的成员。在一个实施方 案中，yqhD核苷酸序列是SEQ ID NO:22, yqhD氨基酸序列是SEQ ID NO:23。
[0117] 在蓝藻中牛产甘油
[0118] 用于产生1，3-丙二醇的生物合成途径的一部分参与甘油的产生，如下所示。前体 磷酸甘油酮通常在蓝藻细胞中容易获得。通过向蓝藻细胞添加两个基因 DARl和GPP2,就能 够产生甘油，如实施例7和12所示。
[0119]
[0120] 向蓝藻供给甘油以产牛1, 3-丙二醇
[0121] 某些蓝藻物种含有甘油转运蛋白，因此能够从培养基获取甘油。甘油目前一般可 作为生物柴油生产的废物而获得。因此，在一个实施方案中，具有内源甘油转运蛋白并进一 步具有至少一些如本文所述的1，3-丙二醇途径基因（dhaBl-3、orf2B/orfZ和yqhD)的蓝 藻物种能够摄取外源添加的甘油以产生1，3-丙二醇产物。甘油供给可以是单次剂量，或者 能够被间歇添加，或者能够被恒定添加。在一个实施方案中，甘油在培养物的光/暗循环中 的黑暗期添加，以促进甘油摄取。
[0122] 蓝藻细朐的转化
[0123] 蓝藻可以通过几种合适的方法转化。能够用本文所述核酸进行转化的示例性 蓝藻包括，但不仅限于，集胞藻属、聚球藻属、Acaryochloris、鱼腥藻属（Anabaena)、嗜 热聚球藻属（Thermosynechococcus)、Chamaesiphon、色球藻属（Chroococcus)、蓝藻属、 Cyanobium、Dactylococcopsis、Gloeobacter，粘球藻属（Gloeocapsa)、Gloeothece、微抱 藻属（Microcystis)、原绿球藻属（Prochlorococcus)、Prochloron、Chroococcidiopsis、 Cyanocystis、Dermocarpella、Myxosarcina、Pleurocapsa、Stanieria、Xenococcus、节方定 藻属（Arthrospira)、Borzia、Crinalium、Geitlerinema、Halospirulina、Leptolyngbya、 Limnothrix、革肖丝藻属（Lyngbya)、Microcoleus、Cyanodictyon、Aphanocapsa、亶员藻 属（Oscillatoria)、Planktothrix、Prochlorothrix、假鱼腥藻属（Pseudanabaena)、 螺方定藻属（Spirulina)、Starria、Symploca、束毛藻属（Trichodesmium)、Tychonema、 Anabaenopsis、束丝藻属（Aphanizomenon)、Calothrix、Cyanospira、Cylindrospermopsis、 Cylindrospermum、节球藻属（Nodularia)、念珠藻属、Chlorogloeopsis、Fischerella、 Geitleria、Nostochopsis、Iyengariella、Stigonema、胶须藻属（Rivularia)、伪枝藻属 (Scytonema)、Tolypothrix、蓝丝藻属（Cyanothece)、席藻属（Phormidium)、Adrianema 等 等。
[0124] 适合于转化蓝藻的示例性方法包括，作为非限制性实例，天然DNA摄取（Chung 等.（1998)FEMS Microbiol.Lett. 164:353-361 ;Frigaard 等.（2004)Methods Mol. Biol. 274:325-40 ;Zang 等.（2007) J. Microbiol. 45:241-245)，接合、转导、玻璃微 球转化（Kindle 等.（1989) J. Cell Biol. 109:2589-601 ;Feng 等.（2009)M〇1. Biol. Rep. 36:1433-9 ;美国专利号 5, 661，017)，碳化娃晶须转化（Dunahay 等.（1997)Methods Mol. Biol. (1997)62:503-9)，生物射弹（Dawson 等.（1997)Curr. Microbiol. 35:356-62; Hallmann 等·（1997)Proc.Natl.Acad. USA 94:7469-7474 ;Jakobiak 等·（2004)Protist 155:381-93 ;Tan 等.（2005)J. Microbiol. 43:361-365 ;Steinbrenner 等.（2006)Appl Environ.Microbiol. 72:7477-7484 ;Kroth(2007)Methods Mol.Biol. 390:257-267 ;美 国专利号 5,661，017)，电穿孔（Kjaerulff 等.（1994)Photosynth. Res. 41:277-283 ; Iwai 等·（2004)Plant Cell Physiol.45:171_5;Ravindran 等·（2006)J.Microbiol. Methods 66:174-6 ;Sun 等· （2006)Gene 377:140-149 ;Wang 等· （2007)Appl.Microbiol. Biotechnol.76:651-657 ;Chaurasia 等·（2008)J. Microbiol. Methods 73:133-141; Ludwig 等.（2008) Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:729-35)，激光介导的转化，或者 在任何聚（酰胺）树状物（Pasupathy 等·（2008)Biotechnol. J. 3:1078-82)、聚乙 二醇（Ohnuma 等.（2008)Plant Cell Physiol. 49:117-120)、阳离子脂质（Muradawa 等.（2008) J. Biosci. Bioeng. 105:77-80)、右旋糖酐（dextran)、磷酸 钙、或氯化钙 (Mendez-Alvarez 等.（1994) J. Bacteriol. 176:7395-7397)的存在下或用其预处理之后 与DNA进行温育，任选地在用细胞壁降解酶处理后与DNA温育（Peirone等.（1998)Mol. Biol. Cell 9:3351-3365);和生物射弹方法（参见，例如 Ramesh 等.（2004)Methods Mol. Biol. 274:355-307 ;Doestch 等.（2001)Curr. Genet. 39:49-60 ;其内容通过提述以其整体 并入本文）。
[0125] 培养蓝藻细朐
[0126] 在一个实施方案中，1，3-丙二醇在蓝藻培养物中合成，通过制备具有本文讨论的 基因构建体的宿主蓝藻细胞并培养这些细胞。
[0127] 培养基的选择取决于蓝藻物种。在本发明的一个实施方案中，可使用如下的BG-Il 培养基生长蓝藻（表1和表2,下文）。当生长盐水物种时，可向培养基中添加 Instant Ocean (35g/L)和维生素 B12 (1 μ g/ml)。
[0128] 表1:示例培养基组成
[0132] 在一个实施方案中，细胞自营养生长，唯一的碳源是CO2。在另一个实施方案中，细 胞混合营养生长（mixotrophically)，例如添加碳源如甘油。
[0133] 培养物在室内或室外生长。培养物可以是无菌或非无菌的。在另一个实施方案中， 培养物在无菌环境下在室内生长，具有连续的光照。在另一个实施方案中，培养物在开放池 类型的光生物反应器中室外生长。
[0134] 在一个实施方案中，蓝藻在一个封闭的生物反应器中生长，量为至少大约100升、 500升、1000升、2000升、5000升或更多。在一个实施方案中，蓝藻细胞培养物在用透明塑 料材料制成的一次性柔韧的管状光生物反应器中生长。
[0135] 光周期可以根据期望设定，例如：连续光照，或者16小时开和8小时关，或者14小 时开和10小时关，或者12小时开和12小时关。
[0136] 从蓝藻培养物分离和纯化1, 3-丙二醇
[0137] 可以使用各种方法用于从蓝藻培养基中除去1，3_丙二醇。关于数种当前使 用的用于分离和纯化1,3-丙二醇的方法的评述参见，例如，Xiu等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:917-926 ;2008。
[0138] 在一个实施方案中，丙二醇在培养物生长期间从培养基中周期性分离。例如，将培 养基与细胞分离，随后是过滤步骤。然后，可以从过滤物中除去丙二醇。如果需要，培养基 可以再次循环回到培养物，或者可以添加新的培养基。在另一个实施方