苯并硫杂蒽类衍生物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学技术领域，具体涉及苯并硫杂蒽类衍生物及其制备方法与应 用。
【背景技术】
[0002] DNA是主要的遗传物质，其大部分结构是以两条互补链通过A:T和G:C碱基配对 形成典型的Watson-Crick双螺旋形式存在。然而，人们发现DNA序列不仅可以形成传统的 双螺旋结构（B-DNA)，在特定的条件下也可以折叠形成其他的非B-DNA结构。这些非典型 的结构有左手螺旋结构（Z-DNA)、发卡结构（hairpin)、三链结构（triplex)以及四链结构 (G-quadruplex和i-motif)等。在这些结构当中，G-quadruplex(G_四链体）引起了许多 来自不同领域中的研宄人员的广泛兴趣和研宄热情。这是因为在端粒末端、原癌基因启动 子区域和RNA序列5'非翻译区的富鸟嘌呤（G)序列可以形成G-四链体结构，这一结构的 形成可以影响包括诸如DNA的复制与转录之类的基因代谢过程。具体而言，G-四链体的形 成和拆散可能涉及到体内的一些重要生理过程，如信号转导、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤的 形成和发展等。此外，G-四链体的结构与人体内双螺旋DNA结构存在着显著差异性，使其 成为抗肿瘤药物的重要潜在靶点。近年来，通过小分子化合物诱导端粒末端及相关癌基因 (c-myc、c-kit、bcl-2···)启动子区域的富G序列形成G-四链体结构，从而达到抑制癌细胞 的增殖和促进其凋亡的研宄备受关注。
[0003] 以B-DNA为靶点的抗肿瘤药物由于缺乏选择性，因而会和正常DNA作用，产生毒副 作用。因此，开发具有高度选择性、高亲和力的靶向基因药物具有重要的意义。G-四链体结 构和B-DNA结构有着显著的差异性，正是这些差异性为许多小分子化合物提供了特异性识 别位点，使其能够选择性的结合G-四链体。小分子化合物和G-四链体的结合位点有G-四 分体（G-tetrad)，沟槽、连接环、磷酸骨架和中央离子通道。根据已有的报道，小分子配体和 G-四链体的作用的模式主要有：端部堆垛模式；嵌插到两个G-四分体平面之间；通过氢键 和静电作用结合到沟槽、磷酸骨架和连接环上；插入到中央离子通道中。
[0004] 端粒，位于真核线性染色体的末端，主要作用为维护染色体及基因组的稳定，防止 染色体末端降解和粘连。端粒的DNA结构由端粒相关序列、端粒重复序列和单链DNA三部 分构成，前两段序列为传统的DNA双螺旋结构d (TTAGGG) /d (CCCTAA)，后一序列为超出双螺 旋结构的一段单链结构d (TTAGGG)，富含鸟嘌呤碱基（G)，称之为G悬突，或3'悬突。据研 宄报道，端粒长度是细胞衰老的标志。在整个生命历程中扮演着重要的角色，与各种细胞老 化的疾病密切相关，比如高血压，阿尔茨海默病，癌症等其他相关疾病。
[0005] DNA复制时不能连续合成端粒的重复序列，人干细胞在分裂过程中，每周期端粒缩 短60-300bp。而在端粒酶激活的细胞中，端粒可以以端粒酶自身RNA为模板通过逆转录合 成后添加到染色体的末端，然后再以延长的亲链为模板，由DNA聚合酶合成子链。端粒酶是 特殊的核糖核蛋白逆转录酶，由蛋白质亚基（人体内的hTERT催化亚基）和一种作为染色 体3'端重复序列扩增的RNA (人体内的hTR)组成。研宄报道，可以通过调控其自身RNA和 蛋白质成分来调节端粒酶的活性。
[0006] 研宄表明，正常体细胞中检测不到端粒酶的活性。因此，人类体细胞经过100余次 的分化，端粒会不断缩短。当其长度缩短到一定长度时，细胞不能再进行分裂而进入凋亡。 然而，在80-90 %的癌细胞中端粒酶是高表达的，持续合成端粒重复序列，补偿正常端粒序 列的丢失，使得恶性肿瘤细胞能在体内或体外无限分裂增殖。实验证明端粒酶的活性对于 癌症的发生和发展具有重要意义。所以，寻找端粒酶的抑制剂靶向端粒和端粒酶是这一领 域的研宄热点。
[0007] 另一方面，程序性死亡受体-I (programmed death receptor-1, PD-1)是在凋亡的 小鼠 T细胞杂交瘤中克隆出来的分子量为55KD的单体I型跨膜蛋白，属于CD28/CTLA-4免 疫球蛋白超家族的免疫抑制性受体。I 3D-I在HIV、HBV、HCV感染的细胞及一些肿瘤细胞中 高表达，与其配体的结合具有削弱、限制或终止T细胞发挥功能的作用，及抑制T细胞的活 化和诱导活化的T细胞凋亡的功能，在机体免疫应答后期的负性调节中发挥了至关重要的 作用。
[0008] 近年来，关于ro-i免疫治疗药物的报道越来越多，百时美施贵宝（BMYUS)的ro-i 肿瘤免疫治疗药物Opdivo (nivolumad)已获得美国FDA审批通过，用于治疗化疗后持续性 的转移性鳞状非小细胞肺癌；除此之外，FDA将罗氏公司H)-L1抑制剂疗法中用于转移性膀 胱癌的实验性药物MPDL3280A认定为"突破性疗法"。新的疗法已大幅度改善了之前存在的 严重或危机生命的风险，这进一步说明免疫疗法治疗癌症定将拥有市场的广阔前景。
[0009] 有研宄报道称，对肿瘤患者使用ro-i抗体的治疗方法，通过阻断ro-1/PD-Li信号 通路，可以使得多种肿瘤产生免疫反应。此外，通过阻断ro-1/PD-Ll的共刺激信号通路，还 可以恢复CTL细胞应答途径上逆转录病毒持续以及慢性感染。免疫检查点可以控制共刺激 和共抑制信号的平衡，而共刺激和共抑制信号在维持自身耐受和调节T细胞应答方面具有 重要作用。目前，免疫检查点抑制剂主要分为抗ro-ι和抗ro-Li抗体两大类。
[0010] ⑴抗ro-i抗体
[0011] 文献报道的抗I3D-I抗体主要分为两大类，包括Nivolumab (0N0-4538)和 Lambrolizumab (MK-3475)。Nivolumab是全人源化免疫球蛋白G4、抗F1D-I抗体，它的出现 一定程度上改变了肺癌对于免疫治疗不敏感、疗效差的观念。MK-3475也是人源化IgG4、 抗ro-1抗体，目前MK-3475联合化疗或比对化疗运用于特定人群的相关实验也正在积极开 展。
[0012] (2)抗 ro-Ll 抗体
[0013] 抗PD-Ll抗体包括BMS-936559和MPDL3280A，BMS-936559是高亲和力、全人源化 IgG4抗体，I期临床试验表明：对NSCLC、黑色素瘤、肾细胞癌、宫颈癌均有明显治疗效果； MPDL3280A是人源化IgG4抗体，I期临床试验结果显示，MPDL3280A具有良好的耐受性及安 全性。
[0014] 理论上抗ro-i、抗ro-Li抗体均可作用于阻断ro-i/PD-Li信号通路，但两者的作 用靶点是不同的，抗ro-i抗体虽然能阻断ro-i与ro-Li、ro-L2的结合，却不能阻断ro-Li 与CD80相互作用；相反的，抗H)-L1抗体能阻断H)-L1与ro-l、CD-80结合，却不能阻断 ro-i与ro-L2的结合，这导致了抗ro-i、抗ro-Li抗体疗效及毒性的差异。所以，抗ro-i、 抗ro-Li抗体适用的人群需继续研宄。而探寻靶向ro-i或ro-i/PD-L信号通路的小分子 药物具有广阔的发展前景。
【发明内容】
[0015] 本发明目的在于提供六种苯并硫杂蒽类衍生物及其制备方法与应用。
[0016] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
[0017] 本发明提供一种苯并硫杂蒽类衍生物，该化合物选自：
[0018] 化合物2a :Ν-(Ν'，Ν' -二乙基胺基丙基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺；
[0019] 化合物3a :Ν-(3-氨基丙基二乙醇基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺；
[0020] 化合物4a :Ν-(3-氨基丙基吡咯烷基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺；
[0021] 化合物5a :Ν-(3-氨基丙基哌啶烷基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺；
[0022] 化合物6a :Ν-(3-氨基丙基吗啉）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺。
[0023] 本发明还提供一种苯并硫杂蒽类衍生物，其特征在于，该化合物选自：
[0024] 化合物I :Ν-(Ν，-Ν，-二甲基胺基丙基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺盐酸盐；
[0025] 化合物2 :Ν-(Ν，-Ν，-二乙基胺基丙基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺盐酸盐；
[0026] 化合物3 :Ν-(3-氨基丙基二乙醇基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺盐酸盐；
[0027] 化合物4 :Ν-(3-氨基丙基吡咯烷基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺盐酸盐；
[0028] 化合物5 :Ν-(3-氨基丙基哌啶烷基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺盐酸；
[0029] 化合物6 :Ν-(3-氨基丙基吗啉）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺盐酸盐。
[0030] 本发明提供所述化合物1~6的制备方法，其特征在于，将苯并[k，l]硫杂 蒽-3, 4-二甲酸酐溶入无水乙醇中，氮气保护下，加入边链胺，加热搅拌回流；苯并[k，1]硫 杂蒽-3, 4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱纯化得到固体； 用最少量的二氯甲烷溶解纯化后的所述固体，再向其中通入干燥的氯化氢气体，室温下搅 拌反应1小时，然后抽滤得目标产物。
[0031] 进一步的，所述制备方法具体包括如下步骤：
[0032] 加边链：将苯并[k，l]硫杂蒽-3, 4-二甲酸酐溶入无水乙醇当中，氮气保护下， 加入1. 5倍当量的边链胺，80°C加热搅拌回流2小时；TLC监测反应至苯并[k，1]硫杂 蒽-3, 4-二甲酸酐反应完全，降温，旋转蒸发溶剂得固体，经硅胶色谱柱纯化得到所述固 体；
[0033] 盐酸化：称取适量上述步骤制得的所述固体，用二氯甲烷溶解所述固体，再向其中 通入干燥的氯化氢气体，室温下搅拌反应1小时，在通入氯化氢气体的过程中溶液逐渐浑 浊，析出目标产物。
[0034] 进一步的，所述边链胺为N'，N' -二甲基丙二胺，所述固体为N_(N'，N' -二甲基 胺基丙基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺，所述目标产物为Ν-(Ν'-Ν'-二甲基胺基丙基）苯 并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺盐酸盐；
[0035] 或者所述边链胺为Ν'，Ν' -二乙基基丙二胺，所述固体为Ν-(Ν'，Ν'_二乙基胺基 丙基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺，所述目标产物为Ν-(Ν'-Ν'-二乙基胺基丙基）苯并噻 吨-3, 4-二甲酰亚胺盐酸盐；
[0036] 或者所述边链胺为Ν'，Ν' -二乙醇基丙二胺，所述固体为Ν-(3_氨基丙基二乙 醇基）苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(3-氨基丙基二乙醇基）苯并噻 吨-3, 4-二甲酰亚胺盐酸盐；
[0037] 或者所述边链胺为3- (1-吡咯烷基）丙胺，所述固体为N- (3-氨基丙基吡咯烷基） 苯并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N- (3-氨基丙基吡咯烷基）苯并噻吨-3, 4-二 甲酰亚胺盐酸盐；
[0038] 或者所述边链胺为3-(1-哌啶基）丙胺，所述固体为N-(3_氨基丙基哌啶烷基）苯 并噻吨-3, 4-二甲酰亚胺，所述目标产物为N-(3-氨基丙基哌啶烷基）苯并噻吨-3, 4-二 甲酰亚胺盐酸盐；
[0039] 或者所述边链胺